生物技术综合实验论文

1绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌里的克隆与表达摘要：研究绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。通过分别将DH-5α(pEGFP-N3),DH-5α(pET-28a)提取质粒、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR、双酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coliDH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶NotI与BamH1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后,通过转化的方法把含绿色荧光蛋（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，挑取单菌落进行活化诱导，用IPTG诱导GFP基因表达，若在紫外扫描仪下观察可以看到显现绿色，则可判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。结果显示构建的重组质粒pET-28a-GFP在E.coli中成功表达。关键词：绿色荧光蛋白质粒重组克隆诱导表达前言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。本实验主要研究的是绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)。绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP发射绿色荧光。近年来,随着GFP在各种异源细胞,如细菌、昆虫及植物细胞中的表达,GFP作为一种新型的报告物在生物学界引起了广泛的关注关于它的基本结构、生色团、发光机理及基因的改造均有大量的研究报道。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白，其分子量为27kDa。GFP作为一种新的报告基因，与以往lacZ、CAT等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性:GFP不具有种属依赖性，在多种原核和真2核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。它是一种操作方便,不用加外源底物,就能在活细胞中检测的分子探针。将彻底改观过去标记方面的研究方法,在分子生物学研究中有广阔的应用景。GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中,都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中GFP最大的缺点就是没有放大作用,它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大。所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量表达。将重组质粒（PET-28a-GFP）分别转入DH5ɑ感受菌中，37°C，扩培45min，在含卡拉霉素的LB固体培养基上筛选，挑取DH5ɑ单菌落于含相应抗生素的LB液体培养基中培养，提取质粒，用双酶切法或TouchDownPCR琼脂糖凝胶电泳检测，将此重组质粒转入BL-21克隆菌，在含卡拉霉素的LB固体培养基上筛选，挑单菌落于液体LB培养基中培养，然后加入IPTG诱导表达，离心，在紫外灯下观察结果，可见绿色荧光。1材料和方法1.1材料1.1.1实验材料克隆菌E.coliDH-5a，表达菌BL21，质粒pET-28a-GFP、pEGFP-N3，限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ1.1.2仪器设备制冰机、离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、冰箱、摇床、恒温3培养箱、超净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、Parafilm膜、离心管等1.1.3主要实验试剂(1)液体LB培养基（PH7.0）蛋白胨10g/L酵母提取物5g/LNaCl10g/L（固体LB培养基是在液体LB中加琼脂粉至1%。）分装后于121℃高压灭菌20min(2)溶液Ⅰ（0~4℃贮存）葡萄糖50mmol/LTris-Cl(pH8.0)25mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L(3)溶液ⅡNaOH0.2mol/LSDS1%(W/V)（用时由母液2mol/LNaOH、10%(W/V)SDS稀释现配。）(4)溶液Ⅲ（0~4℃贮存）乙酸钾(5mol/L)60mL冰乙酸11.5mLH2O28.5mL(5)PCR检测试剂10×PCRbuffer2.5uldNTP(2.5mM)1.0ul上游引物（10uM)1.0ul下游引物（10uM)1.0ul质粒DNA（模版）0.50ulTaqDNA聚合酶0.3ul(6)50×TAE电泳缓冲母液（50mL）Tris-碱12.1g4冰醋酸2.85mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)5mL(7)6×DNA电泳缓冲液溴酚蓝0.25%蔗糖水溶液40%(W/V)(8)卡那霉素（Kan）配成浓度为100ug/mL水溶液，-20℃保存备用。(9)IPTG配成浓度为400mM水溶液，-20℃保存备用。2方法及结果分析2.1重组质粒的构建图1重组质粒pET-28a-GFP的构建流程2.2碱裂解法提取质粒1)挑取单菌落，接种在20ml含100μg/mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养2)分装菌液到1.5ml离心管中，冰浴2min，4℃，,6000rpm离心5min收集菌体，弃上清。（重复）3)将细菌沉淀重悬于100μL冰预冷的裂解液I中，漩涡剧烈震荡，混匀，冰浴5min4)加200μL新配置的裂解液II，盖紧管口，充分混匀（切勿震荡），冰浴5min5)加150μL冰预冷的裂解液III，盖紧管口，使裂解液III分散均匀，冰浴10min，4℃，12000rpm离心10min，移上清液至另一1.5mL新离心管中56)加等体积酚：氯仿（1:1）震荡混合有机相与水相，冰浴3min，4℃，12000rpm离心10min，移上清液至另一新离心管中7)加等体积氯仿：异戊醇，震荡混合，冰浴3min，4℃，12000rpm离心10min，移上清液至另一新离心管中8)加2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA30min，4℃，12000rpm离心10min，移上清液至另一新离心管中9)分两次加入1mL冰预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，除去上清，放置干燥，让酒精挥发10)加25-50μLTE（内含浓度50μg/ml的RNAaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA，保存在-20℃冰箱中。现象观察：加入溶液I后溶液变浑浊，加入溶液II溶液变澄清，.加入溶液III溶液出现白色絮状沉淀，加入氯仿抽提溶液分层2.3质粒的琼脂糖凝胶电泳检测1)称取0.2g琼脂糖于50mL三角瓶中，加25mL1×TBE缓冲液于三角瓶中，电热套加热至完全熔化。2)冷却至60℃左右。3)轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。4)放入电泳缓冲液（1×TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子。5)取5μL质粒溶液及1μLDNA电泳上样液混匀上样。6)50-100v约电泳0.5-1小时。7)用凝胶成像仪进行结果观察。图1为质粒提取的电泳鉴定观察结果分析：提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，实验结果见上图。由于用相机拍摄不太清楚，但与Marker片段作对照，验证质粒提取成功。62.4双酶切重组质粒按如下双酶切体系（20ul）混合反应物体积（l）DW1110×bufferT2质粒DNA5NdeI0.5XhoI0.5水6总计20离心10min，混匀37℃水浴酶切反应过夜。进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果。由下图2可以看到清晰的重组质粒条带图2为酶切鉴定2.5质粒的PCR扩增PCR基本反应步骤：变性、退火、延伸依次混匀下列试剂：反应体系25ul10xPCRbuffer(含镁离子)2.5uldNTP1.0ul重组质粒DNAMarker7上游引物1.0ul下游引物1.0ul质粒DNA1.0ulTaqDNA聚合酶聚合酶0.3ulddH2O18.7ul反应体系混匀后瞬时离心。PCR反应程序①94℃预变性4min②94℃变性30sec③52℃退火30sec30个循环④72℃延伸40sec⑤72℃延伸8min1.2.6DNA的回收纯化及重组质粒的链接1）配30ml1%进口琼脂糖凝胶，尽量长一些，用粗梳子，对PCR产物或酶切产物进行电泳分离2）将PCR产物或酶切产物全部加入加样孔中3）电泳，观察结果，并拍照（紫外线照射不能太久，以免高能量的紫外线打断DNA分子）4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来5）以0.1g凝胶对应3倍体积加入溶胶液6）50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解7）将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm离心60s，弃去废液8）加入800l漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃去废液9）加入500l漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃去废液10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB30l，洗脱缓冲液先在65℃热水中水浴预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm8离心1min12）电泳检测回收产物，余置于-20℃保存13）把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：体系成分体积（l）10×T4DNAligationBuffer1.0T4DNAligase0.5pGM-T载体0.5目的基因产物4ddH2O3.5将反应液混匀，4℃过夜结果分析：图3为PCR扩增的目的基因片段电泳检测由图可清晰的看出DNA片段的大小，大小片段分别用试剂盒回收。1.2.7DH-5α和BL-21感受态细胞的制备1）将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。3）取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。9冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。4）弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。1.2.8感受态细胞的转化和蓝白斑筛选1)取制备好的感受态细胞100μl，冰上解冻，均匀悬浮。2)加入2μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。3)42℃水浴中热击90sec后，冰上放置2min。4)加入200μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。5)取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，用封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。图4（a）图4（b）结果分析：如上图4（a）为实验组平板，长出少量的蓝斑，其余均为呈白色半透明状菌落，表明转化成功。如图4（b），为阴性对照组未出现任何反应，可以排除杂菌的干扰。1.2.8重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达1)取GFP重组菌接种于2mlLB培养液(含Kana100mg/l)中，37℃15