生物显微镜

1实验二十显微镜实验目的:⒈熟悉显微镜的构造及原理;⒉学会显微镜的调整和使用、以及测量微小长度的方法;⒊理解数值孔径与显微镜分辨本领的含义，验证显微镜分辨本领与物镜数值孔径的关系。仪器用具:⒈XSP-18A生物显微镜；⒉测微尺；⒊测微目镜；⒋被测物(透射光栅及生物切片)；⒌2号鉴别率板；⒍光阑及其支架。实验原理:显微镜是用来观察和研究微小物体的助视仪器。显微镜已广泛地应用于现代科学技术和生产和各个领域，没有显微镜的发明和发展，就不可能有现代科学许多领域的发展。⒈显微镜的基本光路显微镜的最主要部分是物镜和目镜。为了简单起见，可以把构造复杂的物镜和目镜都当作是一单独的薄凸透镜。其光路见图1。物镜LO的焦距Of很短，待观察物体PQ放在它前面距离略大于Of的地方(设物距为Os)使PQ经LO后成一放大实象P'Q'(设象距为Os)。然后再用目镜LE作为放大镜来观察这个中间象。中间象P'Q'应放在目镜LE的第一焦点FE以内(设物距为Es)，经过目镜后在明视距离(s＝25cm)处成一放大虚象PQ。因为ssE（1）EEEfss111（2）EOEoffss（3）OOOfss111（4）式中Es代表目镜与显微镜最后成的象PQ的距离，代表物镜的第二焦点OF到目镜的第一焦点FE的距离，即光学间隔。所以在s、Of、Ef、给定不变的情况下,Os是一个确定的数值，其大小略大于Of,Os只有等于这个数值时我们才能通过目镜在明视距离处看到清晰的象PQ。从显微镜中能看到物体的清晰图象时，物镜前表面到被观察物体的距离叫做显微镜的工作距离,它近似等于Os。为了得到清晰图像而进行的调节Os大小的工作叫调焦。Os增长一点或减小一点仍然可以看清物体的图象.这个Os允许增大及减小的最大范围叫做焦深(depthoffocus)。2⒉显微镜的放大本领物镜的横向放大率为PQQPO,目镜的横向放大率为QpQPE而显微镜的横向放大率定义为PQ的长度与物体PQ长度之比，即PQQP，由此可得放大倍数的关系式为EO（5）物镜的横向放大率O近似地等于物镜和目镜的光学间隔(OF到FE的距离)除以物镜的第二焦距,即OOf（6）而目镜的横向放大率可近似为EEfs（7）故显微镜的横向放大率为EOfsfM。当PQ成象在明视距离S时，显微镜的视角放大率与横向放大率数值相等，此时有EOffM25（8）⒊显微镜的分辨本领显微镜的分辨本领是指分辨被检物体细微结构的能力,也就是分辨两个物点之间最短距离的能力。显微镜的分辨本领主要由物镜的分辨本领所决定。设有两个物点A、B，其间距为y，经物镜后成中间像A′、B′，若显微镜是理想成像系统，则A′、B′为两个几何点，但实际上物镜(或其他孔径光阑)将产生衍射，因此A'B'均为衍射图样(如图2)。通常称之为爱里图样，其中心亮盘为爱里斑.爱里斑的半径为1.22Ds/，式中为光的波长，D为物镜(或光阑)的孔径，s为物镜到中间象的距离。因此当A、B两点的距离y小于某一数值时，衍射图样A'与衍射图样B'重合得过多，人们将无法分辨这个重合的衍射图样是一个物点所产生的，还是两个物点所产生的衍射图样。我们把这个临界的y值(即刚刚能分辨的两个物点A、B间的距离)叫做这个物镜的最小分辨距离.根据瑞利判据(在没有几何象差只有衍射效应的情况下)，这个最小分辨距离为NAny61.02sin61.0（9）式中为光波长，n为物与物镜间介质的折射率，为物镜(或其他入射光瞳)对物点的张角。通常把2sinn的值叫做数值孔径(NumericalAperture)，用NA表示。并将其具体数值标在显微镜的物镜上。⒋显微镜的构造3实际使用中的显微镜种类很多，构造也比较复杂。我们实验中将要使用的生物显微镜的构造如图3.老式显微镜多采用直筒镜台，其镜筒是直的，但为了以比较舒适的姿势进行观察,可以借助于镜座附近的倾斜关节向前倾斜镜筒。近年来十分普及的新式镜台为斜筒镜台。这种类型的显微镜的光源就安装在镜座内，镜筒通过棱镜系统向观察者倾斜一定的角度，而载物台呈水平位置，它的聚焦可以通过移动载物台进行，因此镜筒是完全固定的，这就使得在镜筒上可以装置照相机、投影屏、光度计等各种较重得附件，大大开拓了了显微镜的用途。XSP－1８A生物显微镜配有10×，40×，100×的物镜和5×，10×，16×的目镜各一套，将它们相互组合可以得到不同的放大倍数。不同放大倍数的物镜和目镜,，其焦距和孔径是不同的。放大倍数越大，焦距就越短，孔径就越小。在使用高倍镜头时因有焦深小、视场小、工作距离短及视场暗等特点，给调节带来一定困难，使用中要格外小心。这种显微镜在使用人工光源时,可以先开启电源开关(15)，调节亮度钮(16)可以改变灯泡发光亮度以获得最佳照明；使用自然光源时，将集光镜逆时针旋转到位后拿下，换上反射镜，调节反射可获行明亮的视场。物镜是显微镜的最重要元件，是装在一个镜头内部的一组透镜，其中最前面的一块称为“前透镜”,是唯一起放大作用的透镜，其余透镜因只用来消除前透镜的象差,故称为修正透镜。显微镜目镜用的较多的是惠更斯目镜，此外还有一种专门用于测量的目镜叫镜叫做测微目镜，其使用方法已在有关实验中作过介绍.转动粗动手轮(9)可使工作台较快地升高或降低，调节微调手轮(10)可看到清晰的象。转动工作台上纵向移动手轮(7)使工作台同标本作前后方向移动，转动横向移动手轮可使标本作左右方向移动.实验步骤:(一)显微镜的调节和使用:⒈装上目镜和物镜,物镜可装10×及40×两种。先用低倍物镜，转动物镜转换器，听到“咔”的响声后，说明物镜已对准了目镜。⒉接通照明电源并拨动亮度调节钮，使视场内亮度适当。4⒊将被观察的样品放在载物台上，先用低倍物镜寻找被观察的部位。旋动调焦粗调及微调手轮，直到看见清晰的象，将被观察部分利用工作台的纵向及横向移动手轮调到视场中心。如果要用高倍物镜时，可转动物镜换上高倍物镜，然后稍微调节微调手轮，就可以清晰聚焦了(注意：生物显微镜由低倍换高倍这个办法是有条件的，即物与物镜之间不能有东西，或者只有厚度小于0.17mm的盖玻片，否则换高倍镜头用这个方法，镜头会碰到样品造成损失）。⒋由于高倍物镜的工作距离很短，如我们这次用的生物显微镜的工作距离为：10×物镜工作距离为6.3mm，40×时为0.5mm，100×时为0.1mm。调焦一不小心就可能使物镜与被观察物挤压而造成物镜或被观察样品的损坏。为了避免这种事故，我们规定此种显微镜的调焦操作规程如下：先调整旋钮使工作台慢慢升高，使被观察物慢慢靠近物镜头而不接触。做这一步时眼睛必须在旁边监视，千万不要让被观察样品与物镜头相接触！然后眼睛通过目镜观察视场，这时只允许工作台下降使样品与镜头之间的距离增大进行调焦工作。这个规定无论使用多大放大倍数的镜头都必须严格遵守.(二)物镜放大倍数的测定、微小物体的长度测量1．用测微目镜代替显微镜的目镜，调节照明亮度，把测微尺放在显微镜载物台上,调焦。测量测微尺的某一段长度1y(尽量取大些，以减小误差)经物镜放大后的中间象长1y(注意使测微目镜中刻度尺的方向与的1y方向一致)。从而计算出物镜的放大倍数11yyO，与物镜上所标的数值作比较，说明二者不同的原因。.2．将测微尺换成全息光栅，调焦，测出光栅条纹间距y经物镜放大后的中间象长y，由此得出未知长度Oyy/(可测量若干条条纹间距再除以条数得到y)，算出光栅的空间频率y/1。（三）显微镜分辨本领的测定1．仍用10×目镜代替测微目镜，将移测显微镜上用的3×物镜装在生物显微镜的物镜转换器上。转动物镜转换器，使3×物镜对准镜筒。⒉把装在特制套筒里的鉴别率板放在载物平台上，调显微镜的照明并调焦，使2号鉴别率板从显微镜中看去最清楚，并转动工作台的纵向和横向移动手轮，使鉴别率板的图象在视野正中。⒊将带有小圆孔的特制圆罩盖在鉴别率板套筒上，小圆孔与物镜头的距离很近。重新调整载物台的纵向及横向移动手轮，使圆孔与显微镜共轴。⒋从显微镜中看到的鉴别率板有25组方块，每组方块中有四组平行条纹(见图4)，其中单元号码小的平行条纹间距大，号码大的条纹间距小。号码大到一定程度方块中会模糊一片，看不出条纹。记住那个临界的刚刚能看出有条纹的方块号码(每一组中有四个方块，只要一个方块个中看出有条纹就算这一组有条纹)。⒌从本实验的附表中查出2号鉴别率板相应单元号码的条纹宽度，这个便是加了圆孔光阑的被测显微镜实际的最小分辨距离。这是实验测得的y数据(记作实y)。⒍如图5，由光阑与鉴别率板之间的距离d以及光阑的孔径，代入dnNA22sin（10）算出。其中、d的值由测量显微镜测出。将NA值代入(9)式，即可算出理y(理5论)值(其中按550nm计算)。将实y与理y作比较.注意:鉴别率板上复盖有一层较厚的玻璃片，因此不得用高倍物镜去观察它,否则会损坏仪器。用低倍物镜已足够清楚。思考题：⒈一张全息照片的干涉条纹最密得是2500lin/mm，即干涉条纹的空间周期为0.4μm，如欲在生物显微镜下观察，试问不用油镜头又行不行？为什么？(注:生物显微镜的100×物镜使用时要在物和物镜间加油，以便增大NA值，所以把这个镜头叫做油镜头。)已知油镜头(物镜)的放大倍数为100×，数值孔径为1.25，而放大倍数仅次于它的物镜为40×，数值孔径为0.65,照明光波长以于550nm计算。[附表]：分辨率板条纹宽度及分辨率角值分辨率板号2号3号单元号码单元中每组条纹数条纹宽度（μm）f为名义值时分辨率角值（秒）条纹宽度（μm）f为名义值时分辨率角值（秒）1420.015.0040.030.002418.914.1837.828.353417.813.3535.626.74516.812.6033.625.205515.911.9331.723.786515.011.2530.022.507614.110.5828.321.238613.39.9826.720.039612.69.4525.218.9010711.98.9323.817.8511711.28.4022.516.8812810.67.9521.215.9013810.07.5020.015.001499.47.0518.914.181598.96.6817.813.3516108.46.3016.812.6017117.95.9315.911.9318117.55.6315.011.2519127.15.3314.110.5820136.75.0313.39.9821146.34.7312.69.4522145.94.4311.98.9323155.64.2011.28.4024165.33.9810.67.9525175.03.7510.07.50