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源于大蒜的巯基活性化合物抑制上皮细胞的钠通道PatrickKrumma,TeresaGiraldezb,DiegoAlvarezdelaRosac,WolfgangG.Claussa,MartinFroniusa,MikeAlthausa,⇑前言上皮细胞的钠通道（ENaC）是影响跨膜运输钠的一个关键因素，因此也影响到了有机体内盐和水的平衡。ENaC活动失调会导致机体的很多疾病，如高血压、盐浪费综合征、囊肿性纤维化、肺水肿和肠功能紊乱。因此，鉴别影响ENaC活性的新奇的化合物是非常重要的。本文就对大蒜特有的有机硫化合物是否对ENaC有影响进行了研究。人类的ENaC在爪蟾卵母细胞内异源表达，他们的活性是由两个电极电压钳技术测量跨膜电流来判断。从5g大蒜里提取的新鲜化合物减少了爪蟾卵母细胞表达的ENaC的横跨膜电流在10分钟内，这个效果与使用的化合物量有关而且是不可逆的。这是完全敏感的对抑制ENaC的阿米洛利，但对控制卵母细胞不明显。通过二硫苏糖和L-半胱氨酸阻断大蒜的作用表明有巯基活性化合物的参与。大蒜有机硫化合物烯丙基半胱氨酸、蒜氨酸和二烯丙基硫化物对ENaC没有影响。通过对比，源于大蒜的巯基活性化合物蒜素显著的抑制了ENaC。这些数据表明源于大蒜的巯基活性化合物能抑制ENaC。1介绍ENaC是一种异质钠选择性离子通道，它由三个亚基组成α、β和γ。ENaCs广泛表达于脊椎动物的上皮细胞，并且代表了跨上皮吸收钠的限速步骤。钠的跨膜运输通过上皮细胞产生渗透压梯度，从而推动水的渗透跨膜运动。ENaCs因此成为调节有机体内盐水平衡的关键因素。在肾脏中，ENaCs表达于远端肾单位和皮质集合管，在那里他们负责钠从原尿的吸收，因此参与了调控全身盐分和水分的动态平衡以及血容量和血压。在肺部，在气道上皮细胞中表达的ENaCs调节呼吸道液的量和成分，并促进肺泡上皮细胞中肺泡液体的清除。在小肠内，ENaCs表达于对醛固酮敏感的结肠中，并且促进吸收沟中的钠和水。这表明，ENaCs对许多器官的生理作用是非常重要的，也暗示了他们的活动必须被精确调控。在病理情况下，这将变得尤为明显。受损的ENaC的调节与人类疾病相关：在肾脏中，一种高血压的遗传形式被称为利德尔的综合征是由于基因突变，从而导致质膜中ENaCs数量的增加。与之相比，突变引起的ENaC功能丧失导致盐耗综合征遗传性假性低醛固酮症1型。在肺部，增加呼吸道ENaC的活性，可以促进囊性纤维化肺疾病，然而，在远端肺ENaC的活动衰退与肺水肿的形成有关。在肠道内，ENaC的活性受损会导致腹泻。发现新化合物，从而影响ENaC的活动，与上述疾病的生物医学研究密切相关，同时，也是发展一种新型药理工具的先决条件。一个工厂，已深入调查研究了该化合物及其药理潜力，发现是大蒜。在日常生活中，大蒜是一种被广泛使用的调味品。几个世纪以来，大蒜已被确认可以作为一种天然的药物治疗各种疾病，如感染或心血管疾病。大蒜能有这样的益处，是因为其具有抗氧化，抗突变，抗增殖，抗菌和免疫调节的性能。由于其抗菌作用，目前，大蒜正在被研究看其是否能够治疗囊肿性纤维化。在这方面，重要的是探讨大蒜化合物对ENaC的假定影响，由于ENaC的活性较低会导致囊性纤维化的肺部疾病，并且减少呼吸道ENaC的活性，可以考虑作为治疗本病的分子工具。大蒜及其化合物也被认为，可以降低血脂，血浆粘度，血小板聚集，血压等心血管疾病的危险系数。基于ENaCs在肾脏和血压的长期调节之间的联系，可以假设，通过大蒜降低血压，可能是与肾ENaC活性互动的结果。这些例子表明，各种不同的细胞和分子作用归因于大蒜，这可能是病理条件下，也与放松管制的ENaC的活动有关。因此，本文研究了大蒜及其主要化合物对ENaC活性的假定影响。2材料和方法2.1ENaC的异源表达和微电极记录如前所述，去滤泡膜的光滑的爪蟾卵母细胞生长到阶段V/VI时，用cRNA编码培养用作人类ENaC的三个亚基α、β和γ。RNA浓度为5ng/μl每亚基，每个爪蟾卵母细胞被注入18.4nl的体积。注射后24-48小时进行实验。卵母细胞被放置在透明玻璃室内，通过重力驱动系统灌注卵母细胞林格氏液，该溶液含有90mM的NaCl，1mM的KCl，2mM的CaCl，10mM的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸钠盐（HEPES），pH7.4。玻璃毛细血管外径为1.2毫米，被拉到微电极，并填充有1M的KCl。模电压通过双电极电压钳放大器钳位到60mV，跨膜电流（IM）用条状图表记录仪进行连续记录。2.2准备新鲜的大蒜萃取物生物有机大蒜购于当地超市，用一个标准的厨房打大蒜压榨机，将5g新鲜的大蒜压榨进卵母细胞林格液中，将这个溶液冰浴1h，每10min旋转一次。待提取物均匀分布后过滤，得到干净、水溶的大蒜提取物。大蒜提取物必须每次实验前准备新鲜的，然后用卵母细胞格林溶液稀释至工作浓度（1:100到1：1000）。2.3化学试剂和药品的应用DTT和L-半胱氨酸购于Sigma公司，直接用于卵母细胞格林溶液，浓度分别为10mM和20mM。实验记录过程中，有相同浓度的甘露醇存在，以排除渗透的副作用。蒜素和DATS购于LKT实验室，SAC，DAS，DADS，蒜素和阿米洛利购于Sigma公司。SAC用卵母细胞格林溶液溶解至终浓度为1mM，蒜素用卵母细胞格林溶液溶解至浓度为1M，-20℃储存，实验时稀释为1mM。蒜素乙醇原液浓度为10mM，-80℃储存，实验时稀释为100μM，与从5g大蒜中提取的提取物浓度近似相等。DAS和DADS每次实验前由原液制备，用DMSO溶解。DATS的制备是由1M的原液用乙醇稀释而来，原液储存于-80℃。所有的DADS的终浓度都为1mM。实验时有些加了适当的溶剂（DMSO和乙醇）帮助溶解。所有的药物都是在实验前不久用卵母细胞格林溶液新鲜配制的。在卵母细胞中表达的ENaC通过重力驱动灌注系统灌注药物。大蒜素和DATS实验，将含药的溶液注入卵母细胞的腔中，再停止灌注（由于数量药物有限）。孵育10min，将阿米洛利灌注到腔内，用药物溶剂乙醇控制进行。2.4数据分析和统计值表示为平均值±标准差，进行统计分析，对照试验的平均值，采用学生T测试，没有对照实验的，采用未对照的学生T测试。当两个以上的团体进行了比较，采用单向方差邦弗朗尼的多次对比试验。用微软excel2003或Graphpad5进行统计分析。实验数量表明，从至少两个和n个不同的青蛙卵母细胞作为每个实验的供体。P≤0.05的被认为是重要的，数据后面以星号标记。3结果3.1大蒜提取物抑制ENaC通过微电极记录非洲爪蟾卵母细胞共同表达的三个亚基α、β和γ来研究大蒜对人体ENaC的影响。每个实验开始前，卵母细胞用特定的ENaC抑制剂阿米洛利（10μM）灌注，洗脱阿米洛利后，跨膜电流（IM）增加，阿米洛利存在和被洗脱后IM的差值代表ENaC的介导阿米洛利敏感电流（Iami）。大蒜提取物的应用大大减少了IM值，从1.36±0.27μA到0.34±0.09μA，（n=11，P0.05），10min后达到稳定条件。随后增加阿米洛利来评估剩余的Iami，在大蒜提取物存在下的Iami与基线Iami相比大量减少。由于大蒜的作用相当慢，故而用不暴露大蒜提取物的ENaC表达卵母细胞进行了相应的控制。一般来说，表达于卵母细胞的ENaCIM随着时间的推移缓慢下降，在爪蟾卵母细胞表达的ENaCs中，这是一个众所周知的现象。因此，10分钟后的Iami分数总是归于基准Iami。与没有大蒜提取物控制记录相比，有大蒜提取物的Iami显著降低64％。大蒜提取物的作用是不可逆的，因为在洗出10min后Iami没有增加。在大蒜提取物存在下，标准Iami是0.29±0.04，洗出10分钟后是0.22±0.03（n=9，P0.05）。此外，大蒜提取物的作用呈剂量依赖性，在1:100至1:1000内稀释。在阿米洛利存在下，大蒜提取物的作用被很大程度的阻塞。之前的IM值为0.13±0.05μA，暴露于大蒜提取物10min后，IM值为0.08±0.04μA（n=7，P0.05）。大蒜提取物对原本的卵母细胞也无作用。总之，这些数据表明，大蒜提取物有剂量依赖性和不可逆抑制爪蟾卵母细胞异源表达的ENaCs。3.2大蒜提取物中的硫醇活性物质参与ENaC的抑制随后进行了调查，大蒜中的哪种化合物负责所观察到的ENaC的抑制，大蒜中含有多种有机硫化合物，这可能会影响ENaC的活性通过与半胱氨酸残基通道的相互作用，在通道门控中发挥了重要作用。这个假设一致，应清理大蒜提取物的效果，通过高浓度自由L-半胱氨酸。20mM的L-半胱氨酸存在时，大蒜提取物失去作用。用半胱氨酸改性试剂DTT作用时也得到了类似的结果。这些数据表明，源于大蒜的硫醇活性可能化合物参与了对ENaC的抑制作用。与之相比，当ENaC被大蒜提取物抑制后，用DTT作用，阿米洛利敏感电流没有显著增加，说明接触大蒜提取物后，DTT不能回复ENaC的活性。3.3大蒜化合物蒜素抑制ENaC大蒜中的典型有机硫化合物是S-烯丙基-L-半胱氨酸，蒜氨酸，蒜素，二烯丙基硫化物。蒜氨酸位于大蒜细胞的细胞质中，并通过蒜氨酸经酶转化成蒜素，然而蒜氨酸经酶位于细胞的液泡中。因此，需要粉碎大蒜，让蒜氨酸经酶与蒜氨酸接触引发转换成蒜素。蒜素和它的分解衍生物二烯丙基硫化物（DAS，DADS和DATS），使它有了独特的刺鼻的气味。按它们对ENaC的抑制能力，对这些化合物进行了筛选。S-烯丙基-L-半胱氨酸，蒜氨酸和二烯丙基硫化物对ENaC没有抑制作用。然而，来源于大蒜提取物的目前的浓度（100μM）的蒜素导致ENaC活性锐减，与普通大蒜提取物抑制相比，减少了77%。总之，这些数据表明，大蒜中的巯基活性化合物，有机硫化合物，如大蒜素，抑制了ENaC。4.讨论这里所给出的数据表明，大蒜的剂量依赖性和不可逆的抑制表达于爪蟾卵母细胞的ENaCs，这种抑制作用对巯基改性剂是敏感的，巯基改性剂可以通过目前浓度的大蒜中的有机硫化合物蒜素模仿。大蒜素是一种高活性物质，能迅速通过细胞膜扩散，并已被证明与离子通道，如TRPA1，或细胞内的含巯基的分子，如谷胱甘肽，相互作用。通过大蒜素抑制酶，如蛋白酶，对半胱氨酸残基进行改性。巯基群体对ENaC的功能也是重要的，ENaC的每个亚基包含有细胞外loop环中的半胱氨酸结构域以及细胞内C和N-末端的半胱氨酸残基。特别是细胞内半胱氨酸是通道功能的关键，因为突变或改性这些残基能抑制ENaC的活性。如前所述，可能是通过蒜素改性半胱氨酸最终导致了对ENaC的抑制。这个现象是被实验事实所证实的，当有过量巯基组存在时，大蒜提取物失去作用，L-半胱氨酸和DTT实验也可以证明。此外，大蒜的作用不能被细胞外使用DTT所逆转，这点就使细胞内的半胱氨酸残基改性更利于细胞外的loop环。通过大蒜素改性ENaC亚基细胞内的半胱氨酸残基，代表大蒜如何可降低ENaC活性的分子机制。另外，大蒜素可通过修饰酶，反过来调节ENaC的活动，这将与大蒜作用的慢时程一致。几个世纪以来，大蒜是被公认的治疗各种疾病的天然药物，包括心血管疾病。有益效果是由于大蒜有减少心血管疾病，如血脂，血压，血浆粘度和血小板聚集等危险因素的能力。尤其是大蒜对血压调节的影响，是我们正在进行研究的一个主要焦点。有各种各样的研究调查了大蒜对血压和高血压的作用，包括临床试验。然而，对于大蒜是否确实降低了血压或高血压，是很难做出决定性结论的，这主要是由于临床试验方法的缺陷和缺乏详细的分子数据，而缺乏的这些正是解释假定的大蒜具有抗高血压作用所需要的。大蒜化合物，如蒜素或它的代谢产物对肾脏内ENaC的干扰将会减少钠和水的滞留。这可以解释大蒜治疗各种疾病的有益作用，如与受损钠和水平衡有关的盐依赖性高血压，大蒜可作为一种天然疗法。然而，重要的一点是大蒜的生物利用率。据报道，在所筛选的化合物中，只有蒜素能够模拟大蒜的作用，而代谢产物蒜素，二烯丙基硫化物却没有这样的效果。由于大蒜素的反应活性高，其在体内的半衰期极短，有关蒜素在大蒜内负责的生物效应有相当大的疑问。