生物材料预处理细胞破碎和液固分离

第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离•第一节生物材料的预处理•第二节细胞破碎•第三节液-固分离第一节生物材料的预处理•一、确定预处理方法的依据•二、动物材料的预处理•三、细胞培养液的预处理1.生物活性物质存在方式与特点—胞外：多数微生物酶如淀粉酶、蛋白酶、糖化酶常大量存在于胞外培养液中。而合成酶类、代谢酶类、遗传物质和代谢中间物则存在于细胞内，如DNA聚合酶、细胞色素C等。微生物酶是指起着催化作生物体系中特定反应的、由微生物活细胞产生的蛋白质。作为催化剂的微生物酶，它可以加速三种反应：水解反应、氧化反应和合成反应。一、确定预处理方法的依据•1.生物活性物质存在特点•组成复杂，含量低（见后页)–分离纯化难:目的物与杂质的理化性质如溶解度、分子量、等电点等都十分接近，所以分离、纯化比较困难。–容易失活（1）胰岛素是治疗糖尿病的特效药，胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，胰岛素在胰脏中的含量为0.02％，100Kg胰腺只能提取4-5g（50-60），其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，1982年美国一家公司用基因工程手段生产胰岛素，生产成本降低30-50%。（2）人类的生长激素是由191个氨基酸相连、分子量约22000的一种蛋白质。这种激素在幼年时分泌不足造成侏儒症，分泌过多造成巨人症，成年时分泌过多导致肢端肥大症等。过去从死人脑垂体提取作药用，治疗一个侏儒病人约需600具尸体的脑垂体，量少价昂。1979年美国一家基因公司成功地把人的基因移入大肠杆菌生产出生长激素，每升工程菌液含生长激素2.4mg，治疗一例病人只需100多升菌液。目前已开始人工生产并进入临床应用试验。2.后续操作的要求•一般要求：滤液澄清、pH适中、有一定的浓度•不同后续操作有不同的要求•离子交换---高价无机离子、澄清度等严格控制•溶剂萃取---蛋白质含量较低，防乳化3.目的物稳定性•不稳定的：要防失活•青霉素---pH4.8-5.2，低温•蛋白类---高级结构•稳定的：可采用较剧烈的变性和处理条件，沉淀杂质蛋白.如：链霉素，1943年美国S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。•链霉素稳定性较好，可在pH2.8~3.2，75℃加热处理，提高过滤速度。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。二、动物材料的预处理•绞肉机绞碎:提取蛋白质和酶•匀浆和组织捣碎:一些胞内产物不能有效地提取，须通过特殊的匀浆才行。在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器，工业上可用高压匀浆泵。三、细胞培养液的预处理为什么需要预处理？•可溶性粘胶状物质：杂蛋白、不溶性多糖等•粘度增加、影响提取操作•无机盐•在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。（1）加入凝聚剂•凝聚作用：•指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。•某些无机盐可使细胞、细胞碎片和蛋白质等胶体颗粒发生凝聚作用而被去除。1.细胞及蛋白质的处理•胶体粒子稳定的原因：–带同种电荷静电排斥作用–表面水化作用，形成水化层•无机盐促凝聚作用：–加入相反电性电解质，中和胶体表面电荷，降低了双电层的排斥力–无机盐在水中的水化作用，破坏了胶粒水化层•影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。•通常培养液中细胞或菌体带负电荷，常采用高价阳离子促其凝固。•阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+•常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。（2）加入絮凝剂•絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基团多•絮凝作用：–当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的表面上，形成架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤。影响因素：•分子量：大，效果好；过大，溶解度↓•用量：低浓度增加用量有助架桥，浓度过高吸附饱和失去架桥作用，降低了效果。•pH：影响功能团电离度，电离度↑，链伸展，效果↑•操作条件：搅拌：初期，快好；后期，会破坏絮凝团（3）变性作用•天然蛋白质分子受到某些物理因素（如热、紫外线照射、高压和表面张力等）、化学因素（如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等）影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。•用途：杂蛋白质变性沉淀析出•方法：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂、重金属盐或表面活性剂（4）吸附•方法：—加入吸附剂：活性碳除热原—加入反应剂：相互作用形成沉淀吸附蛋白质四环素发酵液：黄血盐+硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液：氯化钙+磷酸盐生成磷酸钙盐沉淀（吸附、助滤），不仅能吸附杂蛋白和菌体等胶状悬浮物，还能起助滤剂作用（5）等电沉淀蛋白质是一种两性物质，在酸性溶液中带正电荷，碱性溶液中带负电荷}而在某pH下，净电荷为零，称为等电点，此时它在水中溶解度最小，能沉淀除去。硫酸软骨素是自哺乳动物气管等软骨提取而得的酸性黏多糖。制备过中先将猪喉(鼻)软骨提取出来盐解后调pH2—3，搅拌10min，静置后再滤至澄清，以除去酸性杂蛋白。有些蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，单靠等电点的方法还不能将其大部分沉淀除去。通常可结合其他方法，如加热、盐析、有机溶剂沉淀等以增强沉淀效果。常与其他方法合用（6）加各种沉淀剂沉淀—沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀（6）加各种沉淀剂沉淀—沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离予如互氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、，苦味酸盐、．鞣酸盐、。过氯酸盐等形成沉淀。在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀只如在四环素发酵液中加入的硫酸锌，可促进一些蛋白质沉淀。2.多糖的去除•酶：转化为单糖–如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶•粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）形成沉淀Mg2+——三聚磷酸钠(Na5P3P10)→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物Ca2+——草酸、草酸钠→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）Fe2+——黄血盐(K4Fe(CN)6)→普鲁士蓝沉淀3.高价金属离子的去除•微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。•动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。•通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。第二节细胞破碎一、机械法1、匀浆法2、珠磨法3、超声波三、化学法1.化学试剂处理2.制成丙酮粉二、物理法1.干燥2.冻融3.渗透压冲击四、生物法1.酶解法2.自溶•一、机械法•原理：剪切力1.高压匀浆器•原理：进入高压室的细胞悬浮液被强迫通过一个狭窄的小孔，产生液相剪切力引起细胞破碎。•易造成堵塞的团状或丝状真菌，•较小的革兰氏阳性菌，•含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。不宜采用高压匀浆法的微生物：2.高速珠磨机•原理：玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，研磨作用，细胞破碎。操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。3.超声波振荡器•原理：利用超声波的空穴作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。•影响因素：超声波的声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、pH、菌体的浓度和种类。–一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20％左右。•超声波破碎法在实验室和小规模生产中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到0～5℃，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。二、物理法1.干燥法原理：干燥后的菌体，期细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25～30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌；冷冻干燥适用于较不稳定的物质。•2.反复冻融法•将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。原理：•细胞膜疏水键结构破裂，增加细胞亲水性•冰晶粒使细胞破裂•适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。3.渗透压冲击法•原理：•细胞在浓盐中平衡，再投入水中膨胀破裂。三、化学法1.加入化学试剂•采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。–碱：溶解除细胞壁外大部分组分，改变pH，改变蛋白质的电荷性质–有机溶剂：如丁醇、丙醇、三氯甲烷等，他们能溶解细胞膜上的脂质化合物，使细胞结构破坏，而将胞内产物抽提出来。但是，这些溶剂容易生物活性物质破环，使用时应考虑其稳定性，操作要在低温下进行，处理后还必须将抽提液中的有机溶剂进行分离回收。三、化学法1.加入化学试剂–表面活性剂：改变膜的通透性，细胞溶解•胞内异淀粉酶：0.1%SDS，30℃振荡30h2.丙酮粉•保存+破碎–脱水脱脂，细胞结构松散方法：•组织或匀浆悬浮0.01mol/LpH6.5的磷酸缓冲溶液中，0℃一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃丙酮内，10min后离心过滤取其沉淀，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥得。四、生物法1.酶解法：•机理：利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键常用的溶酶G+溶菌酶G-溶菌酶、EDTA放线菌溶菌酶酵母菌β-葡聚糖酶霉菌几丁质酶、植物纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物-加入酶：溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等酶解法的优点•发生酶解的条件温和•能选择性地释放产物•胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等•但酶水解价格高，故小规模应用较广•2.自溶：诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。•酵母细胞：45～50℃，12-24h•1.规模及成本–大规模：高压匀浆、珠磨–实验室规模：超声波振荡•2.目的物的稳定性–干燥法、有机溶剂对活性影响大–保护性措施•3.破碎效果和产物释放率–动物细胞：渗透压冲击、冻融法–微生物细胞：结合酶法•高释放率又不能使细胞碎片太小适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面权衡。五、选择破碎方法的依据第三节液-固分离•一、过滤•1.过滤方式：-常规过滤：料流与过滤介质垂直—错流过滤：料液与过滤介质表面平行的大流量冲刷错流过滤优点：•过滤收率高•滤液质量好•减少处理步骤•2.过滤设备•板框过滤机•二、离心分离•过滤式离心机•沉降式离心机•三、影响液固分离的因素•微生物种类•发酵液的黏度•其他：pH，温度，加热时间，助滤剂思考题•1.凝聚作用和絮凝作用的原理各是什么？•2.常用的细胞破碎方法有哪些？•3.固液分离方法有哪些？