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实验一酵母细胞的固定化1.实验目的掌握酵母细胞的固定化方法。2.原理利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。3.试剂和仪器设备鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计4.实验步骤（1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。（2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25mL馏水，搅匀，得B液。（3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。（4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200mL蒸馏水中。（5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。5.实验数据及其处理记录固定化酵母细胞的质量。经实验得酵母细胞称重为26.5g6.实验心得本实验的结果还是挺成功的，通过小组成员的相互协作，最后得到26.5g的凝胶珠，有些凝胶珠大有些小，主要由于将C液注入CaCl2溶液中时，注入的速度有快有慢影响了实验结果，所以要注意保持匀速注入，并且注入时的速度要使凝胶珠尽可能小而且不会连成线。在沸水浴中，通过不断搅拌，避免了凝胶珠中出现气泡而影响实验结果。通过实验掌握了酵母细胞的固定化方法，学会了本实验的实验操作方法以及原理。实验二、蛋白的酶解及水解度的测定1．实验目的通过本实验，要求掌握酶水解蛋白质和测定水解度的原理，并掌握蛋白质水解度的测定方法。2．原理（1）蛋白质酶水解蛋白质的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。与酸碱催化的水解反应相比，它的反应条件温和，副反应少，水解效率高。酶水解蛋白质主要受温度、pH值、加酶量、底物浓度及反应时间的影响。根据不同的蛋白水解酶及底物情况，可设定不同的水解条件进行反应，作比较后，选择最佳的反应条件。（2）水解度测定方法当蛋白质中的肽键全部被水解生成氨基酸时，则水解度为100％，没有被水解时，其水解度为0。由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就生成一个-NH2和一个-COOH基，因此，在测定蛋白质水解度时，只要定量的测定新生成的-NH2和-COOH基的量就可以计算出h值，这样就可以算出蛋白质的水解度。常见的测定水解度的方法有甲醛固定法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(TNBS)、三氯乙酸法和pH-STAT法。本试验采用茚三酮法测定蛋白质的水解度，其原理如下：茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应生成氨，茚三酮、反应产物氨和还原性茚三酮共同反应，生成紫色化合物。利用化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。3.试剂和仪器设备(1)材料：地鳖酶解液(2)试剂：10％NaOH溶液、标准L-亮氨酸（固体）、1％SDS溶液、0.2125M的磷酸缓冲溶液（pH8.2）、茚三酮、KIO3、0.1N的HCl溶液、Arazyme蛋白酶(5000U/g)(3)仪器设备：粉碎机、磁力搅拌机，pH计、离心机、旋转式恒温振荡器、紫外可见分光光度计、分析天平、电子秤、移液管（1mL、10mL）4．实验步骤：⑴试剂的配制①0.5mmol/L甘氨酸标准储备液制备：准确称取37.53mg甘氨酸定容至1000mL容量瓶中，于0℃条件下保存备用；甘氨酸标准使用液制备:分别吸取上述溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，用蒸馏水补足至1mL，相当于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L；②碘酸钾KIO3稀释液制备：称取1.0g碘酸钾溶于蒸馏水中并稀释至300mL，再加入200mL95%乙醇溶液，混匀备用；③茚三酮显色剂制备：称取0.5g茚三酮，用95%乙醇溶解并定容至100mL，此溶液在低温条件下用棕色试剂瓶可保存两周。④pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：A2mol/L醋酸20mL冰醋酸加入到173mL蒸馏水中，混匀；B2mol/LNaAc50gNaAc用305mL蒸馏水溶解，混匀；用A将B调节到pH5.4。⑵原料处理选取干地鳖虫或榨油后的水分含量低，用粉碎机以60目过筛对原料进行粉碎。⑶加水调酸：每次取粉碎好的原料5.0g放入250mL的三角瓶中，按料水比1：20加蒸馏水到三角瓶中，将料液混匀。用10％NaOH溶液调节料液的pH值到8.2，混匀。⑷酶解：向已调pH值的料液中加入Arazyme蛋白酶0.3000g，将三角瓶置入旋转式恒温振荡器内，在37℃、150r/min进行酶解。⑸灭酶：水解1小时后，取出三角瓶在80℃下灭酶15min。⑹离心分离：5000r/min下离心10min，倒出上清液即水解液，稀释20倍备用。⑺水解度的测定：①标准曲线的制定：取25mL磨口具塞比色管6支，分别加入甘氨酸标准溶液1.0mL，再向各管分别加入pH5.42mol/L醋酸缓冲液，茚三酮显色剂各1.0mL，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL，摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min后，取出，用冷水冷却15min，再向各管中加入5.0mLKIO3稀释液并摇匀，30min后于570nm测其吸光度。②测定水解液的水解度：取水解液1.0mL，再向各管分别加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液，茚三酮显色剂各1.0mL，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min后，取出，用冷水冷却15min，再向各管中加入5.0mLKIO3稀释液并摇匀，30min后于570nm波长处测其吸光度。5.实验数据及其处理水解度（Degreeofhydrolysis,DH）是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为：DH=h/htot×100%h-蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数（mmol/g﹒蛋白质）htot-每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数（mmol/g﹒蛋白质）据实验结果表明，大豆蛋白（Soyprotein）,酪蛋白（Casein），明胶蛋白（gelatin）中肽键的毫摩尔数各为7.75，8.0，11.1mequiv/g，而花生蛋白或花生粕蛋白中肽键的毫摩尔数，到目前还没有实验结果的推荐值。但是，利用一种底物进行酶解，选择最佳反应条件时，htot是固定不变的，产生变化的是根据不同反应条件下水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数。所以，本实验可以用h来表示蛋白质水解程度。据测定，干地鳖虫蛋白质含量在60%以上，以60%计；花生粕的蛋白质含量为39.752%，计算时以40%来计算。(参考Adler-Nissen,DeterminationoftheDegreeofHydrolysisofFoodProteinHydrolysatesbyTrinitrobenzensulfonicacid,1977)蛋白的酶解及水解度的测定C(mmol/L)00.10.20.30.40.5入00.1070.1830.2810.3640.489（1）样品吸光度（40倍)=0.517Y=1.0517x+0.00039X=0.517时，y=0.54mmol/lh=0.54mmol/l/3g/40*0.1L=0.72mmol/g(2)样品吸光度（80倍）=0.238Y=1.0517x+0.00039X=0.238时，y=0.25mmol/lh=0.25mmol/l/3g/80*0.1L=0.67mmol/gh平均值=（0.72mmol/l+0.67mmol/l）/2=0.7mmol/g6．实验心得经过这次蛋白的酶解及水解度的测定实验，我学会了酶水解蛋白质和测定水解度的原理以及蛋白质水解度的测定方法。经过四个人的分工协作，完成了实验操作和数据的采集。绘制标准曲线时，有误差较大的数据，可能是由于操作时不当造成误差的出现，在以后的实验中要尽可能的避免。实验三酶解物肽含量的测定1.实验目的随着对多肽生理功能认识的深入，多肽的提取及含量的测定也具有重要的意义。本实验主要目的是掌握利用BCA法测定肽含量的方法及原理。2．实验原理二价铜离子在碱性条件下可以被蛋白质分子中的肽键还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCASolutionA（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。3.试剂和仪器设备（1）原料和试剂原料：地鳖虫酶解物或花生粕酶解物，BCA蛋白质定量试剂盒，蒸馏水试剂：①0.9%NaCl：称取2.25gNaCl，用蒸馏水定容至250mL；②0.5mg/mLBSA标准液移取2.5mL5mg/mL的BSA标准品，加入0.9%NaCl稀释至25mL，既得0.5mg/mL的BSA标准液；③稀释酶液：取地鳖酶解液（工艺同实验三）加入，加入等体积的10%TCA混匀，静置10min，3000rpm离心15min，取上清液，稀释10倍，备用。（2）仪器设备恒温水浴锅、分光光度计、pH计、移液枪、分析天平、秒表或定时钟。4.实验步骤：（1）将试剂A摇匀，用10mL移液管移取10mL试剂A到小试剂瓶中，用移液枪向其中加入200uL的试剂B（即试剂A与试剂B的量要满足A:B=50:1）,充分混匀。BCA工作液在室温24小时内稳定。（2）取0.5mg/mL的BSA标准液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加0.9%NaCl补足1mL。即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mLBSA标准液。（3）取各标准液100uL，加入1mLBCA工作液，充分混匀，于37OC水浴中放置60min，取出后在562nm波长下读其吸光值，做标准曲线。（4）样品液测定：取3支试管，1号加入100uL蒸馏水，2、3号试管加入100uL稀释后样品，再向其中分别加入1mLBCA工作液，充分混匀。将试管于37OC水浴中放置60min，取出后在562nm波长下读其吸光值，根据标准曲线测定含量。5.实验数据及处理肽含量根据样品液的吸光值及BCA的标准曲线计算。Y=0.6937x+0.0421R2=0,9996样品0.5320.527（0.532+0.527）/2=0.53代入Y=0.6937x+0.0421=0.46.实验心得实验结果所得R²=0.9996，接近1，这离不开小组内各成员间相互协作，经过这次酶解物肽含量的测定实验，我学到了利用BCA法测定肽含量的方法。氨基酸的多样性决定了蛋白质功能的多样性，通过测定吸光度来推算出蛋白的浓度，增加了我知识的储备，为以后测定蛋白质提供了方法。实验总会有一定误差，只有尽可能把实验误差降低到最小才会使实验结果更准确，这就要求我们更严谨的实验态度和操作实验的过程。附录：注意事项：1、蛋白标准应在充分混匀后在稀释成不同浓度的标准液。2、由于在做标准曲线时吸取量非常小，要注意移液枪加液的精确。3、试剂A和试剂B混合成工作液时，可能会有混浊，但充分混匀后就会消失，成为淡蓝色的透明溶液。4、BCA蛋白定量试剂盒受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保无EGTA，EDTA低于10mM，二硫苏糖醇低于1mM，B-基乙醇低于1mM。不适用BCA法时建议使用Bradford法蛋白定量试剂盒。还可以考虑用超纯水稀释，透析或除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。5、为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当的用微波炉加热，但是切勿过热。6、如果发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，应考虑使用Bradford法蛋白定量试剂盒。实验四、蛋白酶活力的测定（Folin-酚法）1．实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法。2．原理蛋白酶