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发布日期20051118栏目化药药物评价临床安全性和有效性评价标题生物等效性试验中样本保存及前处理应注意的几个问题作者部门正文内容审评三部李士敏魏农农赵明【摘要】本文对生物等效性试验所用生物样本采集后到检测前在保存过程中应注意的几个方面的问题进行了阐述，希望能对从事此方面研究的人员有所帮助。由于生物等效性试验的样本来源多为血样或尿样，所含的药物浓度较低，内源性干扰成分多，目标药物多与蛋白结合或呈缀合状态，在整个试验过程中，样本测定周期长，测试工作量大，因此其分析方法学的要求与一般的药物分析方法相比具有其自身的特点，我们在建立方法学时，应注重以下几个方面：一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。血浆和血清都需要在采血后及时分离（24小时内），若不及时分离，血凝后再冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，阻碍血浆或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。尿液主要是水、尿素及盐类，是很好的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。生物样品中的一些不稳定的药物（如普鲁卡因、丙酸、红霉素、阿糖胞苷），易受血浆酯酶水解的影响，当采好样品之后应立即加入酯酶抑制剂氟化钠、三氯醋酸等，防制药物分解。易氧化的药物（如儿茶酚类、阿扑吗啡等）一般直接在-15℃仅能保存4周；若样品中加入维生素C或其他抗氧剂，则可稳定10周。生物样品在采样、贮存与分析过程中都应注意可能造成样品的损失或污染，以免将污染物作为药物新的代谢物。二、生物样本贮存期间的稳定性考察由于生物等效性试验样本从采样到检测的周期通常需要几周至几个月，在其贮存期间目标药物的稳定性需经考察验证。含药样本稳定性是指样品中的药物从采样至测定时性质和含量的稳定程度，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数，在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。生物样本稳定性的评价应考察：1、短期室温稳定性：要求高、低浓度样本在4~24h内稳定。考察温度、光照、空气、酶解等因素。2、长期低温条件下的稳定性：从第一个样本采集至最后一个样本的分析为一个考察时间周期，贮存温度一般为-20℃，如果需要也可在-70℃贮存。要求高、低浓度至少分别测定3次，测得结果与第一天测得的相应浓度比较应保持稳定。3、冻融试验：取高、低浓度各3份于-20℃贮存24小时，取出后在室温自然解冻，取样测定，然后再将样品放回冷冻12~24小时，如此重复循环二次以上，分别比较各次测定结果。4、对照液和内标液的稳定性：室温考察6小时稳定性，然后冷藏7~14天或恰当的周期后进行测定，与新配溶液的测定结果进行比较。三、生物样本的前处理方式在测定体液、组织匀浆等生物样品中药物及其代谢物时，首先要将生物样本中的蛋白质除去，使与蛋白质结合的药物释放出来，以便准确地测定药物及其代谢物的浓度。除蛋白的方法有：1）加入与水混溶的有机溶剂及中性盐（如乙醇、甲醇、丙酮和乙腈；硫酸铵、硫酸钠、氯化钠；）；2）加入酸性沉淀剂（如三氯醋酸、高氯酸等）；3）加入重金属离子（如铅、钡、钨酸等）；4）组织的酶消化法（如枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等）。对于与内源性物质缀合的药物同样需先进行缀合物的水解。缀合物水解的方法常用的有：酸水解、酶水解、溶剂解。经过除蛋白或对缀合物进行水解后的生物样本，需进行进一步的提取净化才能进行分析测试，通常可采用液—液萃取或液—固萃取法进行纯化。以上是我们对生物样本采集后到检测前在保存过程中应注意的几个方面的一些看法，希望对进行此方面研究的人员有所帮助。备注