生物膜特征指标测定方法

1第2章生物膜特征指标测定方法选择合适的生物膜指标进行测定和评价非常重要。本研究课题主要的生物膜指标包括：生物膜量、生物膜胞外聚合物的量、活性生物量和生物膜的活性。下面分别介绍它们的测定方法。2.1生物膜量2.1.1生物膜的剥落生物膜固定在载体的表面，很难直接测量生物膜干重。因此，评价载体生物膜量前，必须首先把生物膜从载体表面剥落下来。生物膜的剥落方法很多，其中，有效剥落方法主要有机械剥落、超声剥落和超声加化学剥落。在生物膜剥落在生物膜的多项分析中起关键作用，剥落回收率的高低直接影响其他分析的精确度。（1）机械剥落。对生物膜载体使用简单的机械方法，使生物膜脱离载体的表面。这种剥落方法，简单、易于操作。但该法却不适用于表面具有孔隙或表面粗糙度较大的载体。生物膜机械剥落方法在生物膜反应器中得到广泛应用。（2）超声剥落。利用超声波冲击剥落生物膜。可根据具体情况，选择合适的超声波工作功率。（3）超声加化学剥落。考虑到生物膜胞外聚合物对生物膜的胶联特性，若单纯使用超声波进行生物膜剥落，一般需要超声波的功率较高，作用时间较长。Liu（1994）提出可将生物载体首先置于1M的碱液中，并水浴30分钟，温度控制在60～80℃。经处理后，生物膜与载体表面的胶联度大大降低。这时，再经过超声波处理，可在较低功率及较短时间作用就可得到非常好的剥落效果。2.1.2评价生物膜量的指标（1）生物膜干重。生物膜剥落后，含有生物膜的溶液经事先称重的0.45μm滤膜过滤，把滤膜置于温控105℃的干燥箱内，干燥至恒重，过滤前后的重量之差即为剥落生物膜干重。生物膜干重是生物膜参数中最为常用的指标。（2）生物膜挥发性干重（VSS）。生物膜干重反映的是生物膜总量。生物膜的生物化学活性只与活性生物量相关，而生物膜挥发性干重可以反映生物膜活性生物量。为了获得较准确的活性生物量信息，在生物膜的研究中，常常选用可挥发性生物膜重(Amezianeetal.,2002)。在生物膜干重测量后，将样品置于550℃的马福炉内灼烧至恒重，总干重的失重即为可挥发性生物膜部分。挥发性生物膜重量反映了生物膜中有机组分的含量。2（3）生物膜TOC。细胞的结构骨架主要是有机碳组成。通过测定生物膜总有机碳含量，即TOC，可间接了解生物膜量的变化。特别是对于硝化生物膜等增长缓慢的微生物，其生物膜量一般较少，不便用直接干重法测量。在这种情况下，生物膜TOC的分析更具有准确性。目前，TOC的分析已经仪器化。（4）生物膜COD。生物膜的化学需氧量（COD）可间接描述生物膜量，在生物膜反应器动力学研究中应用较广(Liuetal.,2007)。剥落后的生物膜样品可由传统法测定生物膜COD,也可应用半自动法测定（Jirkaetal,1975）。2.2生物膜胞外聚合物生物膜胞外聚合物（EPS）是生物膜中围绕在细菌周围的高度含水的多聚大分子,其组成和物理化学属性决定生物膜的粘附、构型及生物学特性；EPS由多种有机物组成，包括多糖、蛋白质、核酸、磷脂、褐藻酸、腐质等，主要是多糖和蛋白质(蒲晓芬等,2005)。在生物膜研究中，常常用生物膜中的胞外聚多糖和蛋白质的量代表生物膜中EPS。2.2.1胞外聚多糖聚多糖（Polysaccharide）是细胞增长过程中的一种代谢物质，在细胞固定以及形成生物膜过程中起着重要作用。多聚糖在细胞的分泌、积累与细胞活性及其数量有关，它在生物膜研究中是经常测定的参数之一。多聚糖的测定可根据Dubois等人（Duboisetal,1956）提出的苯酚-硫酸比色法，具体方法如下：生物膜经剥落后悬浮于溶液中，将其pH调到中性，完全混合；取1mL悬浮样品放入清洁试管内，然后加入1mL50g·L-1的苯酚溶液，经10～20s的振荡混合后，再加入5mL95%的硫酸溶液，让其在黑暗中反应10min.；反应结束后，再振荡10s；最后，置试管于20～30℃水浴中10min.;水浴后，在490nm处比色分析。苯酚-硫酸比色法在确定生物膜多聚糖研究中已经非常成功（Belkhadiretal,1988;Liuetal,1994）。2.2.2蛋白质与生物膜重量概念相比，生物膜中蛋白质最重要的特性在于它反映了生物膜的活性。蛋白质是活性细胞的重要组成部分。一般认为生物膜总的蛋白质的含量不超过生物膜总重的5%（Lazarovaetal,1994）。目前，较为常用的细胞总蛋白质的分析方法是Bradford(Bradford,1976)提出的，又称考马斯亮蓝法；这种方法与其他蛋白质分析方法相比具有简便、省时、准确度高的优点。具体分析方法如下：第一步要准备Bradford试剂，取100mgBrilliantindocyaninG（考马斯亮蓝G-250）溶于50mL乙醇中，然后加入100mL85%的磷酸溶液，轻轻震动均匀，最后加入超纯水，并定容至1000mL,然后对其过滤处理，所得到滤液即为3Bradford试剂。经超声波加碱液剥落的生物膜样品，经加入磷酸把其pH调到中性。完全混合生物膜悬浮液后，取1mL样品放入清洁试管中，然后加入5mLBradford试剂，振荡混合10s后，让其在黑暗处反应10min.。结束后，在595处比色分析。Bradford所提出的细胞蛋白质分析法在好氧异养生物膜、厌氧生物膜、硝化生物膜动力学研究中应用极为广泛（Belkhadiretal,1988;Capdevilleetal,1990;Chenetal.,2007）。该法的突出优点是灵敏度高、测定简便快速以及干扰物质少。2.2.3本课题测定胞外聚合物的方法在本课题研究中，聚多糖的测定采用苯酚-硫酸比色法；蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法(Bradford,1976)。2.3生物膜的活性虽然生物膜中的活性物质占生物膜总量的比例很小，但这些活性物质却与生物膜中的生物化学反应密切相关。了解生物膜的活性，对研究和了解生物膜的特性具有很重要的意义（Lazarovaetal,1995;刘雨等，2000）。在本课题研究中，生物膜微生物的活性通过氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行。利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC；ShanghaiReagentCo.,Ltd,Shanghai,China)的还原性产物TTC-甲瓒(TF)的量，来表示微生物的活性。主要步骤如下：（1）生物膜样品的制备取10g载体生物膜，用蒸馏水润洗2次，置于锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动将生物膜打碎，用生理盐水20mL稀释，用玻棒搅动，使成悬液，备用。（2）主要仪器和试剂氯化三苯基四氮唑(TTC)-葡萄糖标准溶液:TTC分析纯0.1g与葡萄糖lg共溶于100mL蒸馏水中，棕色试剂瓶保存；甲苯(分析纯)；三氯甲烷(分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCI缓冲溶液，pH值为8．6；其它：硫化钠。（3）标准曲线的制作在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6mL浓度为lg·L-1TTC-葡萄糖标准溶液，2mLTris-HCI缓冲溶液及lmL10％Na2S新配溶液,摇匀；待溶液充分显色后，准确加入甲苯溶液5mL，振摇，完全提取TF。放置片刻；待溶液分层后，取有机溶液层,移至lcm比色皿中,稳定2min用752紫外分光光度计在波长485nm处，测对应的吸光度(A)值，对脱氢酶活性作图，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。（4）生物膜脱氢酶活性测定4取生物膜制备液2mL于带塞试管中，依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1mol·L-1葡萄糖液、0.5％TTC各2mL，置入37±1℃恒温箱中培养6h后取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入5mL甲苯，振摇，在4000rpm下离心5min，取有机溶剂层比色。在上述条件下，将1h产生1µgTF的量为1个酶活力单位。2.4活性生物量2.4.1活性生物量的分析方法目前，测定生物膜中活性生物量的主要方法有平板计数法和生物化学成分分析法（何振立，1994）。前者是在显微镜下计数，并测定各类微生物体的体积大小，然后根据一定观察面积上微生物的数目、体积及微生物的比重计算出每克生物膜所含的微生物量；或根据微生物体的干物质含量及干物质含碳量(通常为47％)，进一步换算成每克生物膜微生物体的碳含量。微生物的比重、干物质含量及含碳量等参数一般通过纯培养试验获得。直接计数法技术难度大，计数和体积测量都可能发生较大误差，因此不太适宜用作常规分析(BakkenandOlsen,1983;Bratbak,1985)。后者主要有总腺苷酸法、胞壁酸法和脂磷法等，这些方法也受转换因子的限制具有一定的不确定性；此外，这些方法，技术比较繁琐、耗时，在某些测定中，需要比较贵重的仪器等。为方便有效地测定生物膜活性生物量，Findlay等人(Findlayetal.,1989)对脂磷生物化学法的提取、消化和比色等程序加以改进，经过改进后，脂磷法使用更容易，适用范围更广泛。磷脂存在于所有活性细胞的细胞膜中，是所有细胞中生物膜（biologicalmembrane）的主要组分，这些磷脂能被非常灵敏地提取和定量；当细胞衰亡时，磷脂会很快被降解，所以，死细胞中脂磷含量很低。因此，可以用脂磷含量近似表示活性生物量的多少，即通过测定与脂结合的磷的方法来定量生表示生物膜的活性生物量。脂磷分析法测定的是样品的生物总量。脂磷法已经被证明是一种测定生物膜活性生物量的好方法(Arnaizetal.,2007)。生物量的结果以nmolLipid-P·g-1填料（或nmolLipid-P·mL-1填料）表示，1nmolP约相当于大肠杆菌（E.Coli）大小的细胞108个。2.4.2本课题测定生物膜活性生物量方法本课题实验采用脂磷法测定生物膜活性生物量。具体方法为：（1）试剂过硫酸钾、抗坏血酸、钼酸盐溶液按总磷测定的钼酸铵分光光度法制备。（2）工作曲线的绘制以KH2PO4溶液绘制标准曲线(标准贮备液：50μgP·mL-1；标准溶液：吸取标准贮备液1mL移入50mL容量瓶中，稀释至刻度线，摇匀，浓度为1μgP·mL-1)。分别吸取标5准溶液0.00mL，0.05mL，0.10mL，0.20mL，0.40mL，0.75mL，1.00mL，1.50mL，2.00mL加入10mL比色管中，稀释至10mL标线。分别向每个比色管中加入抗坏血酸0.2mL，混匀，30s后加入0.4mL钼酸盐溶液，充分混匀，室温下放置15min。以水为参比，700nm波长，30mm比色皿比色，制作标准曲线(见图2)。（3）样品测定取适量填料，将待测物置于100mL具塞三角瓶中，加入氯仿、甲醇和水的萃取混合液(体积比为1∶2∶0.8)19mL，用力振摇10min，静置12h。向三角瓶中加入氯仿和水各5mL，使得最终氯仿：甲醇：水为1：1：0.9,静置12h。取出含有脂类组分的下层氯仿相5mL转移至10mL具塞刻度试管，水浴蒸干。向试管中加入0.8mL5%过硫酸钾溶液，并加水至10mL刻度，在高压蒸汽灭菌锅内121℃消解30min，按照制作标准曲线的方法测定消解液中的磷酸盐浓度。经换算后，生物膜活性生物量的结果以nmolP·g-1载体表示。6培养液含有的营养物用分析纯试剂配制，其含量分别为（mg·L-1）6H12O6·H2O,930;(NH4)2SO4,17.7;Na3PO4·12H2O,：C4.60;NaH2PO4·2H2O,1.89;NaCl，2.54;KCl,1.91;MgSO4·7H2O,2.05和CaCl2·2H2O,0.74。在配制营养液时，为加速生物膜的形成和生长，其COD维持在120mg·L-1。