生物芯片与食品安全

生物芯片与食品安全§1生物芯片简介及分类§2基因芯片制备及应用第一节生物芯片简介及分类一、生物芯片(biochip)的概念指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。二、生物芯片的分类(一)按载体材料分类玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。(二)按点样方式分类原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片。原位合成芯片：它将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，从而制备成芯片。微矩阵芯片：将用PCR或化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针点或喷点方法直接排列到玻片等载体，从而制备成芯片。特点是密度高、制作方便。电定位芯片：是利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基质、导电玻璃上，从而制备成芯片。特点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。(三)按芯片固定的生物分子类型分类基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室基因芯片技术(genechip):就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。蛋白质芯片(proteinchip):就是选择一种能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)的固相载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质(抗原或抗体)，形成蛋白质的微阵列，然后加入与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子(抗原或抗体)，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。芯片实验室(lab-on-chip):是将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上,这种技术称为芯片实验室。(四)按芯片的使用功能分类测序芯片、表达谱芯片、基因差异表达分析芯片第二节基因芯片制作及应用一、基因芯片技术的概念就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。二、基因芯片的基本原理基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。具体讲即是将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；然后按碱基配对原理将两者进行杂交；再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray三、基因芯片的制备基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制作、样品制备、分子杂交、信号检测与结果分析。PrototypeAmpliOnc™IBiochipAmpliOncTMIBiochipafterhybridization;colorcompositeofred,blueandgreenimageThisbiochipcontainsallgenomicregionsthathavebeenreportedtobeamplifiedincancers.（一）芯片的制备基因芯片种类较多，主要以玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片为载体，制备方法基本上可分为两大类－原位合成和预合成后点样。预合成后点样：是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂在基体上。原位合成：是指利用光导合成的方法在载体表面上逐个合成寡核苷酸，合成后点样可能将十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的cDNA片段固定到载体上制成寡核苷酸芯片或cDNA微阵列。1支持物的预处理载体材料要求：①载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。②使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。③载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜,通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。2芯片的制作目前常用的基因芯片制作方法：接触点样法喷黑法原位合成法（二）样品的准备样品的分离纯化：DNA,mRNA扩增：PCR,RT—PCR，固相PCR探针的标记：已克隆的基因片段、PCR，RT-PCR扩增的基因片段、人工合成的DNA片段，单链、双链、DNA或RNA均可作为探针。荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记,通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对探针的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片,一般需要从细胞和组织中提取RNA,进行逆转录,并加入偶联有标记物的dNTP,从而完成对探针的标记过程。荧光素标记探针多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的探针用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱，常用的双色荧光试剂有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。探针的固化：打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。(三)分子杂交该反应是指标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交，产生检测信号的过程。与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成,可同时平行检测许多基因序列。影响杂交反应的因素：靶分子的浓度、探针浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度、杂交温度和反应时间、DNA二级结构等。(四)信号检测与结果分析芯片经杂交反应后，各反应点形成强弱不同的光信号图像，用芯片扫描仪和相关软件加以分析，即可获得有关的生物信息。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影；若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，得到待测样品的相应信息。信号检测与结果分析激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号软件进行进行图象分析和数据处理四、基因芯片的特点①微型化和自动化。现已出现的芯片面积最大不过525cm２,最小仅有1cm２,;每个阵列中阵点样品DNA的用量仅为5nl(0.5μg/μL)左右;同时杂交和洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅度提高。②高度平行性。基因芯片技术是将待研究的基因制作成芯片,并在同一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析,从而使实验结果具有可比性.③巨大的信息产出率。在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、时间与空间上的差异及遗传信息。④高度敏感性和专一性。能可靠并准确检测出10pg/μL的DNA样品。⑤高度重复性。一张由尼龙膜制作的微阵列，可以重复杂交使用多达20次。⑥强大的类比性。使得以往需多次处理的遗传分析在同一时间和条件下快速完成。⑦哺育新的实验方法。此技术易与其它常规生物技术相融合交叉。基因芯片这些独一无二的特点也代表了后基因组时代技术的发展方向。五、基因芯片的应用基因表达分析：人类基因组编码大约100,000个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mRNA的实验工具很重要。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因。基因芯片测序流程在食品领域的应用：1、采用基因芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将为揭示肥胖的发生机制及预防打下基础。2、可用于营养与肿瘤相关基因表达的研究，如癌基因、抑癌基因的表达与突变，营养与心脑血管疾病关系的分子水平研究。3、食品营养成分的分析、食品中有毒、食源性病原菌的分析和检测等。