生物芯片的研究与应用

《生物芯片的研究与应用》第一章绪论1、传感器：能感受一种信息并转换成可测量信号的装置。生物传感器（Biosensor）：对生物物质敏感并将其转换为可测信号（电信号等）进行检测的仪器。由生物分子识别膜（识别生物分子）、换能器（信号转换）和信号处理器组成。2、生物传感器的分类按分子识别元件分类：微生物传感器、组织传感器、细胞传感器、酶传感器、免疫传感器、DNA传感器。按信号转换器分类：电化学生物传感器、光学生物传感器、压电生物传感器、热生物传感器、磁生物传感器、半导体生物传感器。3、生物传感器的特点：选择性、灵敏度、稳定性。4、BOD分析仪：微生物膜降解有机物，消耗氧，使扩散到氧电极表面的氧减少，引起电流变化。第二章生物反应基础1、DNA杂交：使单链DNA或RNA分子与具有互补碱基的另一DNA或RNA片断结合成双链的技术。即核酸分子间的杂交。2、抗原与抗体抗体的结构：Y型分子、重链（heavychain,H)、轻链(lightchain,L)、链间二硫键、可变区和恒定区。结合方式：抗原表位（抗原决定簇）与抗体结合位点（高变区）互补结合作用力：静电作用力、氢键、疏水键、范德华力单克隆抗体：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。3、DNA组成与RNA的区别DNA：脱氧核糖、胸腺嘧啶；RNA：核糖、尿嘧啶RNA易降解，RNA传感器的研究报道较少。第三章生物敏感元件的制备技术1、DNA固定方法吸附法：（主要由带负电的DNA与带正电荷的固体基材表面通过静电作用将DNA吸附在支持物上。）有直接吸附法、电化学吸附法。自组装膜法：是一种比较理想的固定DNA探针的方法。一般以金电极为基体电极，在DNA探针分子一端修饰上巯基（-SH），利用-SH和金表面的共价结合作用将探针固定在电极上。特点：DNA高度有序，结合牢固，稳定性好，杂交效率高。共价键合法：固定牢固，有利于杂交，但操作繁琐，固定量较少。生物素-亲和素固定法：生物素-亲和素固定DNA时，通常先将亲和素通过共价偶联或静电作用连接于电极表面，利用生物素与亲和素之间极强的专一亲和作用，将生物素修饰的DNA探针固定在电极上。2、抗体固定方法：物理吸附、共价结合法、生物亲和作用（避免抗体直接共价结合，破坏活性位点）、包埋法、交联法（戊二醛）。3、玻片表面共价固定氨基DNA原理第四章电化学生物传感器1、电化学传感器：基于待测物的电化学性质并将待测物化学量转变成电学量进行传感检测的一种传感器。按转化成的电学量分类：电位传感器、电流（安培或伏安）传感器、阻抗（电阻型和电容型）传感器原电池：化学能—电能；电解池：电能—化学能电极反应：通过电极而进行的间接氧化还原反应电位型传感器：将溶解于电解质溶液中的离子作用于离子电极而产生的电动势作为传感器的输出而实现离子的检测，通过平衡电位来确定物质浓度。其中研究最多的是离子传感器。电流型传感器：在一定的电极电压下，通过电极表面氧化还原反应产生的电流与待测物浓度成线性关系。界面双电层的形成。阻抗型传感器：给电化学系统施加一个小振幅的交流信号（电位或电流）扰动电解池，测量电极的交流阻抗（交流电势与电流信号的比值），进而计算电极的电化学参数。常用的电化学分析方法：循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV、方波伏安法（SWV）、线性扫描伏安法（LSV）2、三电极系统工作电极（WE）：电极上发生所研究的反应，常用的有玻碳、Pt、Au、Pb电极；辅助电极（对电极，CE）：与工作电极组成电流回路，使工作电极上电流畅通，以保障研究的反应在电极上发生。参比电极（RE）：电位恒定，不受溶液组成变化的影响，与工作电极组成电压回路，可作为基准来测量工作电极的电位。常用的有氢电极（0V），饱和甘汞电极（SCE，0.2412V），Ag|AgCl电极（0.199V）。当通过电化学池的电流很小时，可由工作电极和参比电极组成二电极测量系统；当通过的电流很大时，参比电极将不能负荷，其电势不再稳定，需采用辅助电极构成三电极测量系统。3、常用的电化学指示剂:(l)酶等具有催化氧化还原作用的电化学指示剂，碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOD）；(2)电化学活性物质(如二茂铁，硫堇等)电化学指示剂；(3)金属纳米颗粒（纳米金等）作为标记物的电化学指示剂。4、设计一种信号放大的电化学DNA传感器第五章光学生物传感器1、光学生物传感器：生物分子特异性反应后，能产生可输出的特征光学信号（荧光、颜色变化等），从而分析待测物并输出可检测的信号。光学生物检测方法种类：荧光生物传感器、化学发光与电化学发光、表面等离子共振（SPR）光纤传感器、比色法及其它2、荧光生物传感器荧光物质：有机荧光染料、有机荧光染料、稀土金属。荧光是一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经过某种波长的入射光（通常为紫外光）照射，吸收光能后进入激发态，并立即回到基态，发出比入射光波长长的光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分子受激发后释放能量的主要方式：发光、发热、转移。常规荧光检测方法：直接杂交法、“三明治”杂交-夹心法。3、荧光共振能量转移法（FRET）当一个荧光分子（供体）的发射光谱与另一个荧光分子（受体）的激发光谱相重叠，且距离足够近时（10nm以内），发生分子间的能量转移，荧光从供体分子向受体分子转移。发生荧光能量共振转移的基本条件：供体的发射光谱与受体的激发光谱相重叠、距离足够近。4、荧光检测标记物种类量子点-荧光染料的FRET：以400nm的光激发量子点（供体）,能量转移至四甲基罗丹明（TMR，受体)，其荧光强度显著增强，可对生物素与链霉亲和素的结合进行检测。分子信标检测法：（1）环状区（长度15～30个碱基的序列，与靶序列特异性结合）、（2）信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构）、（3）荧光基团和猝灭基团（通过共价键连接在茎杆区的末端）荧光基团：如四甲基罗丹明，荧光素等荧光猝灭基团：如4-（二甲基对胺基偶氮苯）苯甲酸，DABCYL杂交前：荧光猝灭；杂交后：出现荧光信号上转换材料的FRET：是一种红外光激发下能发出可见光的发光材料，即将红外光转换为可见光的材料。其特点是吸收的光子能量低于发射的光子能量，这种现象违背Stokes定律，又叫反Stokes发光材料。共轭聚电解质的FRET：有聚苯撑乙烯(PPVs)、聚苯撑乙炔(PPEs)、聚芴(PFs)、聚噻吩(PSs)；共轭主链具有良好的光学特性，具有水溶性基团，保证其水溶性。荧光共轭聚合物的信号放大原理（分子导线）5、时间分辨荧光法标记物为稀土金属——镧系元素优点：特异性荧光与非特异性荧光分离、零背景、高特异性6、化学发光生物传感器化学发光剂或发光物：在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。（1）直接化学发光剂：直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。有吖啶酯、三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+（2）酶促反应发光剂：利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需要酶催化后发光的发光剂。鲁米诺：与氢氧化物反应时生成了一个双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。（3）AMPPD7、直接化学发光免疫分析8、化学发光酶免疫分析（1）辣根过氧化酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化酶标记化学发光免疫分析示意图（2）碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图9、电化学发光免疫分析电致化学发光（ECL）是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。三联吡啶钌的电化学发光原理：化学发光剂[Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应，二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+，并迅速自发地脱去一个质子(H+)，形成自由基TPA•。由于[Ru(bpy)3]3+是强氧化剂，自由基TPA•是强还原剂，两个高反应基团在电极表面迅速反应，[Ru(bpy)3]3+被还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+，TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。发卡DNA探针处于折叠状态，标记有Ru化合物的尾部贴近于电极表面，产生很强的ECL信号；DNA杂交后Ru化合物远离电极表面，ECL信号降低。10、表面等离子共振生物传感器当光由光密介质（折射率大）射向光疏介质（折射率小）时，折射角将大于入射角．当入射角增大到某一数值时，折射角将达到90°，这时在光疏介质中将不出现折射光线，这就是全反射。表面等离子体:指在金属表面存在的自由振动的电子与光子相互作用产生的沿着金属表面传播的电磁波。金属膜表面介质中存在等离子波，当消逝波与等离子波相遇时可发生共振。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使得反射光的能量急剧减少。SPR对物质结合检测的基本原理:用仪器检测反射光，可从光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角为SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比.纳米金颗粒信号增强的SPR检测:11、光纤生物传感器光导纤维简称为光纤，主要材料为石英玻璃。中心圆柱体为纤芯，围绕纤芯的外层为包层。纤芯和包层主要由不同掺杂的石英玻璃制成。由透明材料做成的纤芯，周围采用比纤芯的折射率稍低的材料做成包层，将射入纤芯的光信号，经包层界面全反射，使光信号在纤芯中传播前进。光纤传感器的类型：功能型、传光型光纤传感器的特点：光纤传感器的分类：（1）光纤-SPR生物传感器（当倏逝场的区域内生物分子发生识别反应时，金属薄膜表面的折射率会随之变化从而改变表面波的共振角度。共振角度变化的幅值取于分析物在该区域的结合数量。）（2）光纤倏逝波生物传感器（当光以一定角度入射时，在纤芯与包层的分界面上就会产生全反射，部分光会垂直于分界面透射至包层中，但透射波的幅值随着透射深度的增加而呈指数衰减，所以只能存在一段很小的距离，一般在波长量级，这种波就称之为倏逝波。作为生物传感器使用时，要将传感段的光纤包层去除，当分析物与识别分子发生生化反应时，会被吸附于纤芯表面，从而影响倏逝波的透射深度，这时传输光能量就会发生变化，通过检测传输光的特性就能得到被测生物分子的特征。）（3）光纤光栅生物传感器（被测生物分子被吸附于生物膜上使生物膜层的厚度增加，从而改变了传感器表面有效折射率，使透射谱中吸收峰的谐振波长发生变化，所以通过检测光纤谐振波长的漂移可以得到被测生物分子的浓度。）（4）光子晶体光纤传感器12、表面增强拉曼光谱（SERS）生物传感器拉曼散射属于弱散射，拉曼光谱信号强度弱，相当于入射光的10-6~10-8。吸附在粗糙金属表面的化合物可产生极大的拉曼增强效应，拉曼信号增强103~107倍。基于AuNP-DNA系统的腺苷SERS检测：纳米金聚集导致结晶紫的SERS信号增强：基于纳米金修饰石墨烯的多重DNA检测：滚环扩增SERS检测DNA：13、比色法及其它金标银染DNA检测（灰度值）：纳米金比色法：纳米金分散液（红色），团聚后的纳米金分散液（蓝色。适配体修饰纳米金用于凝血酶的金试纸条检测：基于适配体-纳米金的溶菌酶比色检测：14、酶联免疫吸附实验（ELISA）借助酶标记抗体（或抗原）在体外与抗原（或抗体）结合，通过相应底物被酶催化后出现显色反应，反应颜色深浅与抗原（或抗体）量的多少有关。显色反应可通过ELIS