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1一种玉米激酶与对于黑穗病的抵抗力强弱之间的关系周伟良晁清张楠叶建荣谭国清李佰林邢月先张博琦刘海军KevinAFengler赵静赵贤荣陈永生赖锦盛严建兵徐明亮黑穗病是一种典型的由土壤传播的S型黑穗病黑粉菌真菌引起的对全球的玉米产业造成重大威胁的玉米疾病。一种主要对黑穗病有重要抵抗作用的名字为Qhsr1的基因被定位在玉米2号染色体。这里我们报告了QHSR1的图位克隆以及QHSR基因对于疾病抵抗作用的分子机理。以下精确的测量和基因改造互补测定证明了ZmWAK是QHSR1基因中的关于对于玉米黑穗病有强烈抵抗作用的相关片段。ZmWAK跨越了细胞质膜，潜在的作为一种细胞激酶的受体去感知和传递细胞外的信号。ZmWAK在植物抵御丝孢堆黑粉菌的活体营养的地方表达的十分旺盛。中胚轴损害的表达损害了ZmWAK阻碍抵御机制。ZmWAK基因的删除在被人工繁育并传播的玉米的种胚中表现出影响，并且ZmWAK激酶的作用范围在玉米的进化过程中受到了限制。玉米（ZeamaysL.）是世界范围内种植最广泛的一种农作物，并且是一种重要的食物和动物饲料的来源同时也是生物工程和其他工业工程的重要原料来源。当时间推移到2015年时，人类的人口总数预计将达到92亿（数据参见URLs）为了满足如此多的人口的粮食需求，不仅不断改进提高主要农作物的生产潜力是十分必要的，而且不断减少生产过程中的生物和非生物损失也是十分必要的。玉米黑穗病是一种由S型黑粉菌引起的在全球大多数玉米种植区发生的玉米疾病，而且玉米黑穗病在爆发期间会造成巨大的损失1。这种土壤携带的名为S型黑粉菌的病原体会侵入玉米幼苗并且在其中盎然生机地生长至玉米刚刚进入花期，这时，黑粉菌的生命模式转变成高效的形成孢子，这个过程引起在玉米花簇中大规模的芽孢囊群的出现，所以这种玉米疾病被叫做“黑穗病”。S型黑粉菌也可以一起玉米花穗的变叶病以及玉米的生长矮小2。玉米黑穗病导致被感染的植物在生产方面的能力完全丧失，而最为经济和环境友好的降低生产损失的方法就是繁育并充分利用杂种玉米的抵抗力优势。在和其他的谷物农作物，比如大米（Oryzasativa）和小麦（Triticumaestivum）进行比较后发现，玉米在数量上拥有更少的已经被广泛的在种畜行业应用的对于疾病有抵抗作用的基因。玉米中只有三个基因属于那些被应用于种畜业的基因——Hm1（赋予玉米对于玉米叶枯病菌1型抵抗力），Rp1-D（赋予玉米对于一直常见锈病，普通锈病的抵抗力）和Rxo1(赋予玉米对于大米的细菌性条纹病的抵抗力)——已经得出结论成为能为玉米的一些抵抗力提供相应原因的基因4-6。相反的，玉米在数量上相对来讲具有更多的在土地中可以施展的反击大多数疾病的场所。7累积渐增的多重性的对于抵抗力方面的微小的影响可以最终产生出对于疾病较高甚至完全的抵抗力。8,9而且，在数量上的抵抗力通常来说比在品质上的抵抗力更加持久有效。10,11然而，对于赋予植物这种在数量上抵抗力的基因的图位克隆法已经被证明是极其困难的，原因如下：1.较小的基因方面的影响，2.在不同的地理和年份疾病的严重的基因方面的变异，3.疾病的症状在进化过程中的单调均匀性的缺失12-15.迄今为止，只有一种在玉米中名为QTL的基因被确定与玉米中具有对于茎秆炭疽病腐烂病的抵抗力的一种变种的产生有因果关系。16这里我们将作出关于Qhsr1基因图位克隆的报告，并且我们将探究该基因与抵抗力之间联系的分子机制。2成果对于Qhsr1基因的精确定位我们事先在玉米的2号染色体长臂上发现了Qhsr1的显性基因，该基因可以降低高达25%的黑穗病发病率。（ref.17）这种基因在各种各样的种群测绘时总是被确定出来。18,19通过同位素标记法辅助选择的方法测定关于黑穗病的易感线可以逐年取得值得注目的降低黑穗病的发病率的效果，这证明了Qhsr1基因对于玉米黑穗病的控制力的巨大潜力。20为了精确定位qshr1基因，我们制造了Ji1037(具有较高的抵抗力)和Huangzoa4(较为容易被感染)的回交杂种的多代进行对比，并且在qhsr1基因的附近发展出密度较高的分子等级的标记。（参见补充表格1）。通过利用一种源于实验计划21号的重组细胞，我们成功的得到了140个重组细胞，并最终将qshr1基因限定在了标记STS1M3和标记STS3M1之间的一个侧面上（参见补充图片1a-c）。和数量性状基因座分析结果一致的是，qshr1基因在多重回交杂种种系中能够降低18.6%到26.7%的黑穗病发病率。（参见补充图片1d）ZmWAK是候选的关于抵抗力的基因Qhsr1基因中对于STS1M3片段和STS3M1片段的标记可以被用来去显示Mo17基因（和QHSR1基因具有相同的区域）而且被存录在了图书馆里。Qhsr1基因中包含的BAC片段克隆体被安排了顺序并且添加了注释。有趣的是，QHAR1基因的区域在STS1M3标记物的侧面。并且STS3M1片段的长度在玉米生产线上在一定的大体范围内变化。Mo17片段的长度为152kb，然而，HZ4间隔的长度仅仅为5kb。这在147kb上的删除可以用来解释为什么我们无法在玉米的生产线上得到存在在STS1MSHE，STS3M1的基因片段的这个结果。进一步而言，我们选择了一些关键的重组细胞来形成一个杂交的种系群落。拥有152kb的删除的段落对于疾病的发病率降低了20%，这个结果从而证明了在该区域中，QHRlin基因的存在。在Mo17和ZmWAK和ZmHCH和ZmTIF和ZmXa21-land和ZmXa21-2之间qhsr1的一段长度为152kb的基因间隔中有五种有解释作用的基因。我们将来自B733（一种拥有抵抗力的近交系，对于在土地上的5%的疾病来说）一种的相应的基因序列和预测的Mo17基因排列起来，这表明了在B73中ZmXa21-land和ZmXa21-2的完全丢失。然而，基因片段ZmHCHand和ZmTIFhad被宣称在结构上存在不同点而只有ZmWAK是完好无损的。（参见补充图片3）。一种对于RNA的表达的试验证明了ZmWAK在品种名为Ji1037的玉米幼苗的全部组织中表达，然而，ZmHCH和ZmXa21-1仅仅分别在在植物的根部和芽胚鞘中精确的表达。ZmTIF和ZmXa21-2在检测中没有在任何的组织中被检验到。（参见补充图片4）。此外，我们在每一种表达的基因上进行了标记（参见补充图片5）并且在有62个不同的对于疾病既不是有抵抗力也不是易感染的近交系的一个控制板上研究了关于变异基因的存在问题。我们发现ZmWAK和ZmHCH在所有的拥有抵抗力和一些容易感染疾病的品系中都是存在的，然而ZmXa21-1在容易感染疾病的品系和拥有抵抗力的品系中都是随机存在并被我们发现的（参见补充图片5b）。同样的我们发现，这些结果暗示ZmWAK很可能是与qhsr1基因的抵抗力起到决定性作用的基因。为了证明我们关于ZmWAK基因参与了对于玉米黑穗病抵抗力的形成的假设，我们从一个Mo17BAC片段上隔4离出一个长度为13.1kb的染色体组碎片，其中包括了完好无损的译码以及一段长度为3.92kb的ZmWAK基因的启动子区。通过介绍在玉米杂交品种Hi-II之中的外来ZmWAK基因可以将三种单独的转基因实验联系起来（参见资料2a）。我们将品种T1和品种HZ4（缺少ZmWAK基因）杂交来产生F1品系。转基因的品系F1和品系HZ4之间既不是自交也不是回交来产生F2，BC1F1和BC2F1种系来进行功能性互补的实验。在BC1F1和BC2F1种系（排除实验1-1中的BC1F1种系）中，转基因植物的疾病发病率在和它们同科属的非转基因的植物的对于疾病的抵抗力相对比来说是显著降低的（达到19.2%—26.9%，P0.05）。在F2种系中，转基因植物，既包括纯合子也包括ZmWAK的外生的异形接合体，的发病率降低了26.5%—42.8%（参见资料2b）。相对地，由实验17-2和9-21中得到的转基因植物与HZ-4Qhsr1（一种和QTL的近等基因系产生的HZ4）中观测到的产物水平可以比得上，然而，从实验1-1中得到的转基因植物表现出了异乎寻常的低表达水平（参见资料2c）。此外，我们用一个ZmWAK的RNA的介入改变了Hi-II基因的结构，并且转基因T1植物经过和Ji1037品系杂交两次来产生BC1F1品系。所有的来自五个独立实验的转基因BC1F1品系在和非转基因T1品系相比较时表现出对于玉米黑穗病抵抗力的降低，虽然只有实验2-119中表现出了非常明显的抵抗力降低（P0.05,参见资料2e）。抵抗力降低的现象使我们联想到了在植物体内ZmWAK的对应RNA表达量的极低的表达水平（参见资料2f）。除了1-21号实验体，其它的的转基因植物相对于Ji1037来说，表现出了对于ZmWAK基因的表达能力的增强，并且这种现象可能与杂种优势有关。全部的这些结果表明Qhsr1基因中的ZmWAK片段是植物对于黑穗病的抵抗力的来源。ZmWAK的特性我们通过隔离从Ji1037品系中获得的RNA来完整的获取了ZmWAK基因的序列抄本。ZmWAK基因编码了一种与联合激酶家族有关系的一种拥有独特作用范围蛋白质受体，这个激酶家族中包括了细胞质中的丝氨酸和苏氨酸的激酶，皮肤表面的钙调节蛋白生长因子激酶以及细胞外的半乳醛聚糖粘合剂激酶（参见图片1dand和资料图6a）。WAKs组成了一个参与了植物生命中许多方面过程的蛋白质的大家族。在鼠耳芥和拟南芥中，WAK类似蛋白通过多种标志性的途径参与了植物的生活，包括了植物对于疾病的抵抗力，植物对于重金属以及铝的耐受力以及植物的生长。在谷物粮食中，基因WAK族通过在进化中发展出拥有不同的组织特异性的种类来进行扩张，并逐渐的控制了外部分泌物的产生，引起了表达的模式。玉米中有大于100的注释WAK基因分布在多重的染色体上。在精氨酸（转）存在的情况下，精氨酸在具有催化作用的冬氨酸盐的相邻位置，这时WAK基因可以被分类于第三激酶和非5第三激酶中。不像它的来自鼠耳芥的同源基因（编码第三激酶）的是，ZmWAK基因编码了一种非第三激酶（参见资料图片6a）。大多数的辨别保护性微生物或者病原体分子的模式辨别受体都是非大三激酶。在系统发生的分析中，在玉米中由ZmWAK基因编码的第三激酶和非第三激酶具有在所有的三个领域中的完全的版本（GUB,EGF-CA和激酶），并且趋向于在不同的枝系中的分离的丛组，这暗示了他们的在功能上的不同（参见资料图片6b）。我们检验了在洋葱表皮细胞中和玉米原生质体中融合了加强的绿色荧光蛋白后ZmWAK基因进行的短暂的表达情况。我们发现ZmWAK基因在质壁分离的前后会使原生质薄膜局部化，与它们作为细胞外的接收器的预测作用有关。我们也检验了在Ji1037秧苗和成年植株（在抽穗之前）的不同的组织中基础的ZmWAK基因的表达情况，我们发现在不同的组织中表达的程度不同。例如在幼苗中，ZmWAK基因的表达产物在中胚轴中比在叶子或者根部中高了大约10个单位，然而在成年植株中，ZmWAK基因主要在地面上方的第一个节间和顶部的叶子中表达（参见资料图片3f）。此外，在胚芽鞘中ZmWAK基因的表达在植物面临混合米丝轴黑粉菌孢子虫的近亲混合交配的挑战的12小时后开始被引起而表达。在鼠耳芥中，AtWAK1感受器可以察觉到一种植物细胞壁的退化的名为寡聚半乳糖醛酸的产物，并且AtWAK2基因被发现与细胞胶质以及细胞组织的膨胀的现象有关。在已知ZmWAK基因与AtWAK基因的序列的相似性很高的条件下，我们假设ZmWAK基因在渗透压的调节中具有相似的作用。于是我们构建了一种有关于细胞质领域的激酶以及对于鼠耳芥油菜素内酯不敏感的外功能区的嵌合感受器。（BRI1）(参见图片3h)。我们介绍玉米原生质体内的结构来确定是否嵌合的感受器能够感觉到细胞外的不拉西诺内酯的对于细胞内的WAK激酶的含量的下降，并且调节恢复正常状态。用布拉西诺内酯处理会造成由不带菌的细胞转化而来的细胞高达81.5%的几率死亡，这个结果与没有转化的细胞相比没有什么明显的区别（89.7%的死亡率）。通过对比，在具有嵌合BRI-Zm