生物转化常见反应类型.

第三章介绍生物转化的常见反应类型以甾体化合物的生物转化为例进行阐述•甾体化合物和甾体药物简介甾体化合物结构甾类化合物常见种类甾体化合物和甾体药物简介•1952年，美国普强药厂的Morray和Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为11黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药物生产中的重要性。•微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转化。•几种重要的甾体微生物转化发应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要手段甾体化合物•一类含有环戊烷多菲核的化合物•在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部分双键；17位有不同的测链。目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域•将微生物基因工程的新技术应用于甾体微生物转化•提高水不容性底物的溶解度•细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利用•发展经济有效的产物连续回收方式•将环糊精等应用于培养基以提高产量甾体化合物结构菲环戊烷多氢菲甾体化合物编号2345167891413121115环戊烷多氢菲101617甾类化合物常见种类动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。植物中：薯芋皂豆甾醇酵母细胞：麦角固醇甾体化合物编号2345167891413121115环戊烷多氢菲101617甾类化合物常见种类动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。植物中：薯芋皂豆甾醇酵母细胞：麦角固醇甾体类激素药•肾上腺皮脂激素类可的松、强的松、氢化可的松功能：抗炎、抗毒、抗过敏对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗作用。•生殖腺激素孕酮、雌酮功能：调节内分泌•人工合成避孕药长效孕酮等微生物在甾体药物生产中的应用主要分为两大类•将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体，雄甾－4－烯－3，17－二酮；雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮。•转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所需要的产物。如：甾体11，11及16羟化，∆1脱氢甾体边链降解微生物对甾体化合物的转化•微生物对甾体化合物的转化多种多样•它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能进行生物转化。•其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。•包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、形成内酯、侧链断裂、降解。羟基化反应是甾体微生物转化中最重要的反应。化学法除了较容易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入羟基。微生物对甾体的羟基化作用•微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，也可在非甾类有机分子上羟基化。•简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入O原子。•在甾核上至少有21个位置可以发生。•11位羟基化作用最重要，11位C的氧化对可的松药物疗效是不可缺少的，11，11。•除11位C进行羟基化反应外，9，14，16的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类化合物及其类似物。进行甾体羟基化作用的微生物转化物质作用位置微生物代表孕酮1111黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等弯曲孢霉化合物S1111黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲霉假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头霉11脱氧皮脂酮11弯月弯孢霉雌二醇16巨大芽孢杆菌羟基化反应机理羟基化反应由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因此被定义位单氧化酶。这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的形式存在。同位素实验证明甾体羟基化中存在的问题环糊精的生理作用Hesselink等研究：应用环糊于分枝杆菌甾体边链的降解。•环糊精是一种环状寡聚糖，一般由6－8个葡萄糖分子通过－1，4糖苷键连接而成。•易溶于水。•含有疏水性空腔，可与疏水性分子结合。•可作为几种甾体类药物的稳定剂和增溶剂。环糊精的应用实例1•Chincholkar等研究了在环糊精存在时，CurrulariaVKMF-644对11－脱氢皮甾醇（ReichsteinS化合物，简称化合物S）的11羟基化。在底物浓度为4g/L时：•化合物S：－CD＝1.0:0.6氢化可的松的产率为70％－75％•无－CD：氢化可的松的产率为40％－50％环糊精的应用实例2•GD：19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－双酮•经Penicilliumraistrickii进行15羟基化――――口服避孕药∆5－D－十八甲基炔诺酮（gestodene）的重要中间体。•Schlosser等研究表明：在－环糊精存在时，菌株或其固定化细胞对CD的15羟基化作用，与以甲醇做溶剂比较，其转化率都能明显提高。环糊精作用•环糊精有利于提高甾体底物溶解度•真菌能以环糊精作为C源其他重要的羟基化反应•地索高诺酮（destogestrel）新型避孕药（荷兰Organon公司推出）•作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠•我国研究：上海医科大学史纪平•19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－双酮―――11羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键中间体•简化合成路线，降低副反应。•底物：0.2%转化率：36％甾体的边链降解侧链降解•微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用原价的原料开辟了新的途径。•常见微生物有：•简单节杆菌•球形芽孢杆菌•玫瑰芽孢杆菌•淡紫青霉•藤黄诺卡氏菌•甾体边链降解•甾体母核降解3－羟基－∆5甾醇9羟基化，∆1，2脱氢3－酮－∆4化合物微生物种类不同∆1，2脱氢，9羟基化氧化甾体边链降解•采用类似脂肪酸氧化的氧化过程，最后形成C17酮甾体。选择性边链降解问题•选择性边链降解策略（3）辅助基因工程•提高边链降解的产率策略选择性甾体边链降解措施1•对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降解例如：1965Sih等将胆固醇先行改造为19羟基衍生物再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。选择性甾体边链降解措施2•加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C1，2脱氢酶和9羟化酶。如：NiCoPbSe8－羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选性边链降解金属鳌合剂2，2－双联吡啶抑制母核降解选择性甾体边链降解措施3•对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株例如：•原始菌株经诱变为诱变菌株Mycobacteriumsp，NRRL-B3683不加抑制剂，便产生雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）•再诱变得Mycobacteriumsp，NRRL-B3805，无C1，2脱氢酶能产生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD）基因工程新技术的应用专利：•Pseudomonas菌株无降解甾体的能力•将MycobacteriumspNRRL-3683的DNA导入Pseudomonas菌株中获得重组菌。•重组菌可在水相，一种或几种有机相中进行转化反应。•Pseudomonas菌株比MycobacteriumspNRRL-3683的生长输率快•结果加快转化进程，降低成本。方法•分离纯化MycobacteriumspNRRL-3683的DNA•整合到特定质粒载体中•导入噬菌体中•用入噬菌体感染E.coliHB101，得E.coli重组子•三亲杂交实现MycobacteriumspNRRL-3683的DNA到Pseudomonas菌株得转移。如何提高甾体边链降解的产率接触提高甾体边链降解速率•Hesselink等研究表明：环糊精能明显增强MycobacteriumspNRRL-3683降解胆固醇、谷甾醇等边链生成AD的产率，不影响细胞生长速度和细胞密度。•当环糊精：底物浓度=2:1时，微生物降解边链的活性可增加1.7-3.0倍。•环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑制。环糊精在甾体边链降解中的作用总结•在甾体边链降解过程中，环糊精充当：•惰性甾体增溶剂•反应载体•保护剂甾体边链降的成功应用Arhna和Sih等研究报道以胆甾醇和－谷甾醇为原料微生物转化法合成甾体药物中间体的方法。•采用酶抑制剂•生化阻断变株•改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从而选择性控制甾醇的边链降解成功合成中间体雄甾－4－烯－3，17－二酮（4－AD）雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）9羟基－4－AD目的：工业生产性激素，利尿剂等甾体药物其他的甾体生物转化反应类型•脱氢作用•A环芳香脱氢作用－使甾体核形成双键强的松（去氢可的松）是可的松经脱氢而形成的。其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备该种药物时，常常是将可的松或氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可的松。脱氢反应的常见微生物为简单节杆菌各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌）镰刀霉长蠕孢菌属。A环芳香化所谓A环芳香化是指甾体A环核上的每个C原子都脱氢形成双键，而变为芳香化结构。雌性激素的生产（雌二醇），可通过此方法获得研究生物转化的几种常用方法第四章研究生物转化的几种常用方法•间歇培养法•整体细胞转化法•洗涤均丝悬浮法（静息细胞法）•孢子转化法•原生质体实验法•遗传特性诱变法•同位素示踪法间歇培养法（Batchculture)这种方法能够比较直接而简单地筛选能否具有转化某种化合物的活性菌株。发酵液作用培养一定时间定量待转化物鉴定游离的整体细胞•游离的整体细胞直接作为催化剂来制造产品的报道已经不少•在某种程度优于固定化细胞•在生物转化酶工程中越来越受到重视•游离整体细胞的基础研究更为重要游离整体细胞的基础研究内容•细胞的渗透化•酶的胞内固定化•酶细胞在反应前后的形态变化和结构变化整体细胞转化应用举例•底物：富马酸•产物L－天冬氨酸•生物转化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）•转化菌株：E.coli整体细胞转化研究底物浓度细胞形态与结构催化反应速度细胞的渗透性关系培养基培养方法不同底物浓度的反应速率•底物质量浓度较高时，在某一时间（8h）前，转化速率较低，而后，反应速度加快。对底物富马酸盐的转化彻底。（99.2％）•底物浓度较低时，反应速度始终较慢对底物富马酸盐的转化不彻底。（63％）特点：•高质量底物浓度有较高的反应速率•高质量浓度底物有较高的转化率•催化反应一般有个迟滞期酶细胞在生物转化中的形态变化低底物浓度扫描观察酶细胞在生物转化中的形态变化高底物浓度扫描观察形态学变化•高质量底物浓度下细胞发生明显的形态学变化•细胞表面发上皱褶，有明显的凹陷•细胞膜变薄，松弛、不明显，内部结构变松，不致密。高质量浓度底物对含酶细胞的渗透化作用静息细胞法为了排除原培养基中自身的代谢产物对不同生长阶段转化的影响，常常用洗涤的静息细胞来代替发酵液中的生长的细胞，即将不同生长阶段的细胞取出，洗去沾染的原培养液及其代谢产物，然后把细胞悬浮在人工转化系统内，在一定条件下进行生物转化。孢子转化法真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物转化。细菌的内生孢子（芽孢），一般无转化活性。转化方法相似于静息细胞法。不采用完全培养基，只选用缓冲液或含有葡萄糖一类能源的物质即可。通常转化时使用的孢子浓度为108－109个/ml.转化pH一般为5-6原生质体试验法方法通过溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱去细胞壁，获得原生质体。将原生质体悬浮于高渗稳定液中，添加前体物质，进行喂养试验，观察结果。原生质体试验法特点排除了细胞壁通透性障碍。保全了整体细胞的内酶系统。避免了无细胞抽提法中，用破碎细胞而损坏了酶体系，从而使某些需要偶联的酶反应（氧化还原反应）不能进行的缺点。遗传特性诱变法菌种诱变不仅是提高产量的重要手段，而且也是研究生物转化过程中，产物形成的遗传机制的一种有效方法。将转化菌进行诱变，使其失去转化底物或形成某个中间体的能力，从而就可分离到生物转化中的各种不同的障碍突变株，即负突变株。这种负突变株能够积累某种代谢产物或支路代谢产物。从分析转化菌和突变株的代谢产物化学结构上的差异，找出这些代谢产物在合成中的相互关系，从而可推断生物转化的反应步骤。同位素示踪法同位素示踪法是研