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1选修1生物技术实践第一部分微生物的利用1．微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。2．细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少，。划线最后，可使细菌间的距离加大而分离。将接种后的固体培养基培养10～20小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，形成菌落，不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释到10-5～10-7之间，然后去0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。1.在培养微生物时，必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的，各种培养基也必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌（防止杂菌污染）。进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。2.细菌扩大培养要用LB液体培养基（通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样（五类：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子）。实验1大肠杆菌的培养和分离培养细菌常用的培养基是LB培养基。实验步骤：1、配制培养基并灭菌配制50mLLB固体培养基（用于制作平板进行分离培养）和50mL2液体培养基（用于菌种的扩大培养），灭菌常用高压蒸汽灭菌，在1kg压力下灭菌15min。2、倒平板倒平板过程在超净台上进行，待灭菌锅内没有压力，打开锅盖，冷却到60℃，用酒精消毒桌面和手之后，在酒精灯火焰旁倒平板。3、扩大培养将斜面上的菌种用接种环接种到液体培养基中。接种环使用时先将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，应先使接种环接触培养基以达到冷却的目的，然后再取菌体。4、划线分离用灼烧灭菌过的接种环蘸取菌液，在固体培养基平板上连续划线，如果划4次线，接种环共需灼烧5次。将培养皿倒置，在37℃恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单菌落，并且越是最后划的线，菌落之间的距离越大，表明菌已被分离。5、斜面保存菌种在无菌操作下将单菌落用接种环去除，用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱冷藏保存。实验2分离以尿素为氮源的微生物脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。其利用脲的反应式为：本实验的内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌，观察菌落数，以LB全营养培养基为对照。材料：玻璃刮刀（也叫涂布器）LB全营养固体培养基（其中的凝固剂用的是琼脂糖而不是琼脂，因其不含N）尿素固体培养基（尿素高温下易分解，所以其他成分用高压蒸汽灭菌，尿素最后用灭菌后的G6玻璃漏斗过滤后加入，用琼脂糖是为了保证尿素是唯一氮源，加入酚红是为了检验尿素分解后NH3的生成，该指示剂酸性、中性、碱性下依次为黄、橙、红色。）实验步骤：1、配制培养基、灭菌、倒平板2、制备细菌悬液在无菌条件下，将1g土样加到99mL无菌水（在进行培养基灭菌时同时灭菌处理过的蒸馏水）的三角瓶中，振荡10min，即为10-2土壤稀释液。取0.5mL该稀释液，加入4.5mL无菌水中，振荡，即为10-3土壤稀释液，依次类推……3、用涂布分离法分离细菌用无菌移液管（在进行培养基灭菌时同时灭菌处理过）取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL，分别加到LB培养基和尿素培养基的培养皿中，用玻璃刮刀涂布均匀。玻璃刮刀保存在70%的酒精溶液中，使用时取出放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。4、培养培养时需恒温，倒置。5、观察。使用稀释涂布法还可以进行活菌计数。这样计数的结果比真正的活菌数小。第二部分酶的应用实验4果汁中的果胶和果胶酶果胶是植物细胞壁的主要成分，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。果胶不溶于乙醇，这是3鉴别果胶的一种简易方法。可以从黑曲霉和苹果青霉等真菌中提取果胶酶。果胶酶用于果汁制作，可以提高出汁率和澄清度。实验6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测酶在水溶液中很不稳定，也不利于工业化使用。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。淀粉被水解的过程为：α-淀粉酶β-淀粉酶糖化淀粉酶淀粉——————→糊精——————→麦芽糖——————→葡萄糖（遇碘显蓝色）（遇碘显红色）（遇碘不显色）实验中使用的枯草杆菌的α-淀粉酶的最适pH为5.5-7.5，最适温度为50-75℃。实验步骤：1、α-淀粉酶的固定化将5mgα-淀粉酶溶于4mL蒸馏水中，再加入5g石英砂，不时搅拌，30min后装入1支下有夹子注射器中，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤除去未吸附的游离淀粉酶。2、将固定化酶柱放在架子上，加淀粉溶液，使其以0.3mL/min的流速过柱。一段时间后接收流出液，用KI-I2溶液检验，呈红色。3、实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤，4℃保存。几天后，重复实验，结果相同，说明固定化酶可以重复使用。第三部分生物技术在食品加工中的应用实验8果酒及果醋的制作1，酿酒和制醋有关的微生物分别是酵母菌（真菌）和醋杆菌（细菌）。制作酒和醋的过程：在糯米或大米与酒曲混匀后，放在温度较高的地方，米先变甜，即生成了糖，这是由于黑曲霉或黑根霉的淀粉酶将淀粉水解成糖。甜度增加后，再放到温度低的地方保持厌氧条件，酵母就开始工作，使糖变成酒（糖酵解）。反应式。如果时间太长，在有氧条件下，醋酸菌就开始作用，将乙醇氧化成乙酸，也就是变酸生成醋。反应式。2，用葡萄制作葡萄酒时，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本实验为了加速反应，使观察更直观，需要有更多底物参加反应，所以加入酵母使酒精发酵占有优势。使用高锰酸钾溶液浸泡葡萄的目的是为了防止杂菌污染，也是消灭了野生酵母。发酵瓶中的液体不能装满是因为发酵过程中气体产生，如果装满会使液体外溢，导致发酵液损失和瓶口等处污染杂菌，影响产物品质。用装着水的弯曲玻璃管可以防止氧气进入，发酵产生的二氧化碳可以出去，还可以防止空气中杂菌的污染。1，制醋有固态发酵和液态发酵，本实验属于固定化菌体连续发酵工艺。制醋时要向发酵瓶中通入空气，保证发酵是一个氧化过程，要用棉花过滤是防止空气中的微生物进入。4实验10泡菜的腌制和亚硝酸的测定1，泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌。这类食品含有乳酸和丰富的维生素、矿物质等营养成分，但蛋白质含量低，还含有一定量的亚硝酸盐。所用原料是白菜、洋白菜等。在无氧的条件（由所用容器的凹槽加水再加盖造成）下，微生物利用菜中的糖和其他营养物进行发酵，乳酸菌将糖分转化为乳酸，这是需氧菌被杀死；当有机酸增加到一定程度时，乳酸菌被杀死，出现酵母和霉菌，并逐渐产生亚硝酸。加白酒的作用是可抑制杂菌的生长，也是一种调味剂，增加醇香感。加盐不要太多，否则会使乳酸菌发酵迟缓。温度高则发酵快，但口味差些。2，杂菌较少的原因是乳酸菌产生的乳酸球菌肽对许多革兰氏阳性菌有抗菌作用，蛋白质含量低，白酒的抑制作用等。3，亚硝酸盐是对人体有害，引起中毒，可致癌的物质，由假丝酵母产生。可与对氨基本磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N—1—萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量分析。实验步骤包括样品处理、测定、标准曲线（以亚硝酸钠质量为横坐标以光密度OD值为纵坐标）、计算[亚硝酸盐含量（mg/kg）X1=通过标准曲线得到的亚硝酸盐质量（ug）m2×1000×样品处理液总体积V1/样品质量m1×测定样品液总体积V2×1000）]。第四部分浅尝现代生物技术实验11植物组织培养1．植物无性生殖的方法有扦插、嫁接和组织培养等。植物组织培养有两种形式：愈伤组织培养（固体培养基、琼脂培养基）和细胞悬浮培养（液体培养基）。植物组织培养的原理是细胞的全能性。植物组织培养的应用在快速繁殖、除去植物病毒、新品种的培育（诱变育种、花药或花粉的单倍体培育、细胞融合、基因工程等）、品种资源的保护、某些代谢产物（如色素、芳香物质等）的生产等方面。植物组织培养的过程包括脱分化和再分化。2．培养基是组织培养时植物组织或器官赖以生长和发育的营养条件。包括植物需要的大量元素、微量元素、有机成分、激素和琼脂。培养基中通常加一定量的蔗糖是除作为营养成分外，还用于维持一定的渗透压。3．细胞分裂素/生长素的摩尔浓度比决定组织是生根还是生芽，当两者比例高时（细胞分裂素＞生长素），诱导芽的生成；两者大致相等时（细胞分裂素=生长素），愈伤组织继续生长而不分化；两者比例低时（细胞分裂素＜生长素），诱导根的形成。但实验中不用天然激素而是用人工合成的激素（如奈乙酸NAA、6—苄基氨基腺嘌呤BA等）是因为植物中存在相应的分解天然激素的酶而没有人工合成激素的相应的酶，所以天然激素在植物体内作用和存在的时间短，人工合成激素的作用和存在的时间长，作用效果明显。最常用的MS培养基（生芽培养基、生根培养基）。配制过程包括称量、溶解、调PH、融化、分装（三角瓶）、加盖、灭菌等步骤。3．培养过程应该在无菌的条件下进行，实验经过外植体—愈伤组织—丛状苗—生根苗—移栽植株。需要一定的光照和温度的条件。