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选修三《现代生物进化理论》1、DNA重组技术的基本工具：（1）限制性核酸内切酶—“分子手术刀”。又称限制酶。来源：主要从原核生物中分离纯化出来的。特点：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。形成两种形式—黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶—“分子缝合针”分为两类：E·coliDNA连接酶（只能连接黏性末端）和T4DNA连接酶（两种末端均能连接）。（3）基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”常用质粒作为载体。还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。在细胞中能进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。在进行基因工程的操作中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。2、基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。（1）目的基因的获取是实施基因工程的第一步。可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。目前常用的方法有：从基因文库中获取目的基因。利用PCR技术扩增目的基因。在核苷酸序列已知的情况下，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。（2）基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子、以及标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。标记基因的作用使为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（3）将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。将目的基因导入植物细胞采用的最多的方法是农杆菌转化法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。将目的基因插入到Ti质粒的T—DNA上就可以使目的基因进入植物细胞并插入到染色体DNA上。还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞采用最多的是显微注射技术。将目的基因导入微生物细胞：原核细胞的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。所以受体细胞常用大肠杆菌，转化的方法是：首先用Ca2+处理细胞使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。然后混合完成转化。（4）目的基因的检测与鉴定是检查基因工程是否做成功的一步。是否插入目的基因采用DNA分子杂交技术。是否转录出mRNA，是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。采用分子杂交技术。是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交。个体水平的检测需要做抗虫或抗病的接种实验。基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。3、蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。4、植物细胞工程：（1）植物组织培养：原理：植物细胞的全能性。核心是脱分化和再分化。条件：离体培养，严格的无菌环境。营养物质（如水、无机盐、蔗糖、维生素等）植物激素（生长素和细胞分裂素），适宜的温度和光照。脱分化要避光培养。固体培养基大多数都是由无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成。（2）植物体细胞杂交：(1)过程①为去除细胞壁获得具有活力的原生质体，常用的方法是酶解法，所用到的酶是纤维素酶和果胶酶。(2)过程②是原生质体的融合，人工诱导的物理法包括离心、振动、电激等。化学法一般用聚乙二醇(PEG)作诱导剂。(3)过程③是原生质体融合后再生出细胞壁，这是原生质体融合成功的标志。(4)两两融合的原生质体的三种类型：AA、BB、AB，符合要求的只有AB，因此需要进行筛选。植物体细胞杂交的原理：原生质体融合的过程利用了细泡膜的流动性，杂种细胞发育成杂种植株利用了植物细胞的全指性.植物体细胞杂交的意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。杂种植株遗传物质的变化：细胞融合属于染色体变异，杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，形成异源多倍体。若两个不同品种的植物细胞A、B进行融合，A含有2M条染色体，2个染色体组，B含有2N条染色体，2个染色体组，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为2M十2N。利用的原理有细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。包括的环节有原生质体的融合和植物组织培养。优点：克服不同生物远缘杂交的障碍。植物细胞工程的应用：植物繁殖的新途径：（1）微型繁殖技术（快速繁殖技术）植物组织培养不仅可以保持优良品种的遗传特性，还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。（2）作物脱毒：植物分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无毒，切取茎尖进行组织培养。获得脱毒苗。（3）制造人工种子：所谓人工种子，就是以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。优点是可以完全保持优良品种的遗传特性，生产上不受季节的限制。人工种皮中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等，为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮加入一些植物生长调节剂。作物新品种的培育：单倍体育种；突变体的利用；细胞产物的工厂化生产：细胞产物包括蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。植物生长调节剂在组织培养中的作用：常用的植物生长调节剂一般可以分为生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类。此外脱落酸和多效唑也可以用于植物的组织培养。生长素用于诱导细胞的分裂和根的分化。常用的生长素有IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚-3-丁酸）、NAA(萘乙酸)和2,4-D。其中IBA和NAA广泛用于诱导分化生长物的生根，并能与细胞分裂素互相作用而促进茎的增殖。2,4-D常用于植物愈伤组织的诱导和生长。细胞分裂素类：细胞分裂素的作用使促进组织细胞的分裂或从愈伤组织和器官上分化出不定芽，比较常用的细胞分裂素有6-BA，KT和玉米素，其中6-BA一般用于诱导植物的愈伤组织分化出丛芽、而KT的作用主要是刺激培养物的细胞加速分裂加快培养物的生长速度。赤霉素类：主要作用使刺激培养细胞的伸长，所以在组织培养中一般使用赤霉素来刺激分化的丛芽或小植株快速长高。生长素与细胞分裂素的比例适中，且生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成；当细胞分裂素的效应高于生长素时，则主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。5、动物细胞工程：动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。6、动物细胞培养：就是从动物细胞中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。首先将组织分散成单个细胞，方法是取出组织块、剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞，用培养液制成细胞悬液，放入培养液中培养。具有细胞贴壁现象。因此要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒，易于贴附。当细胞相互接触时，出现接触抑制。原代培养指动物组织消化后的初次培养。传代培养分瓶继续培养的过程。传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去，一般来说，细胞在传至10~50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能会发生变化。获得不死性。目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。动物细胞培养的条件：（1）无菌、无毒的环境：对培养液和所用培养用具进行无菌处理，通常还要在细胞培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染，应定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。（2）营养：需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。（3）温度和PH：哺乳动物多以36.5±0.5℃，适宜的PH为7.2~7.4（4）气体环境：细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用使维持培养液的PH。培养时将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体。动物细胞培养技术的应用：（1）生产生物制品如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）可以作为基因工程的受体细胞，（3）培养的动物细胞还可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。（4）用于生理、病理和药理方面的研究。7、动物体细胞核移植技术和克隆动物动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。体细胞核移植过程：动物体细胞克隆包括动物细胞核移植和胚胎移植。原理是动物细胞核具有全能性。体细胞核移植技术的应用前景：（1）可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育（2）保护濒危物种（3）转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白。转基因克隆动物细胞、组织和器官可以作为异种移植的供体；人的核移植胚胎干细胞经过诱导分化，形成相应的组织、器官后，可以用于组织器官的移植。（4）可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；更好的追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病。体细胞核移植技术存在的问题：（1）成功率低。（2）绝大多数克隆动物还存在健康问题。（3）克隆动物食品的安全性问题存有争议。8、动物细胞融合①概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，又称细胞杂交。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞②原理：细胞膜的流动性。③诱导融合的方法：常用聚乙二醇、灭活病毒、电刺激等诱导融合。④意义a.打破种间关系，克服远缘杂交不亲和的障碍。b.是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。c.为杂交瘤细胞技术发展与单克隆抗体的制备开辟了新途径。9、单克隆抗体（1）注射抗原获得B淋巴细胞（2）杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。（3）杂交瘤细胞的筛选用特定的选择性培养基。对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，获得能分泌所需抗体的细胞。（4）采用体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖提取。（5）单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。（5）单克隆抗体的应用：作为诊断试剂。在诊断的应用上，具有准确、高效、简易、快速的优点；用于治疗疾病和运载药物。主要用于癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其他疾病。10、体内受精和早期胚胎发育（1）精子的发生从初情期开始直到生殖机能衰退。卵子的发生，胎儿时期完成了卵泡的形成和在卵巢内的储备，这是精子和卵子在发生上的重要区别。当在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。（2）受精发生的场所：输卵管内，包括：受精前的准备阶段和受精阶段。准备阶段：(1)精子获能：(2)卵子的准备：卵子要在输卵管内进一步成熟，到减Ⅱ中期，才具备与精子受精的能力。(3)受精过程主要包括：精子穿过放射冠和透明带，进入卵细胞膜，原核形成和融合。受精阶段——四步曲第一步：顶体反应，透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障。第二步：卵细胞膜反应是防止多精入卵受精的第二道屏障。第三步：原核