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1专题一基因工程1.基因工程的基本工具是：限制性核酸内切酶，DNA连接酶，运载体。2.限制性核酸内切酶破坏的是磷酸二酯键，它可以使DNA分子产生两种末端：黏性末端和平末端。3.DNA连接酶可分为两类：EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶。前者只能连接黏性末端，后者两种末端均能连接。连接的是磷酸二酯键，不是氢键。4.常用的运载体是质粒，除此之外，动植物病毒，噬菌体也可以充当。5.质粒是分布在细胞质中的一种小型环状DNA分子。原核生物细菌，真核生物酵母菌中均有质粒.6.作为运载体通常具有三个条件：A能在宿主细胞中复制并稳定地保存；B有一至多个酶切位点；C有标记基因，便于重组DNA的选择。7.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。8.获取目的基因的方法：从基因文库获取目的基因，利用PCR技术扩增目的基因。9.基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因文库可大可小，如果它包含了一种生物所有的基因，就叫做基因组文库；如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫部分基因文库，如cDNA文库.10.PCR技术多聚酶链式反应原理：DNA的复制；前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据它合成引物；原料：四种脱氧核苷酸；酶：耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)过程：变性（95度），复性（55度），延伸（72度）11.基因工程的核心是基因表达载体的构建，基因表达载体的构成主要有四部分：目的基因，标记基因，启动子，终止子。12.目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，叫做转化13.将目的基因导入植物细胞的方法有：农杆菌转化法，基因枪法，花粉管通道法.将目的基因导入动物细胞的方法：显微注射技术导入细菌：用Ca2+处理细菌，增加其细胞壁的通透性，成为感受态细胞，再在一定温度下使重组DNA进入细菌细胞14．目的基因的检测和鉴定：首先检测目的基因是否插入染色体DNA上检测方法是DNA分子杂交技术其次检测目的基因是否转录，检测方法是DNA分子杂交技术最后检测是否翻译，方法是抗原—抗体分子杂交技术。生物学水平的检测：观察或检验转基因生物是否具有特定性状215．基因工程的应用a、植物基因工程成果：（括号中表示常用目的基因）抗虫转基因植物（Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制基因、植物凝集素基因等）抗病转基因植物（病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、几丁质酶基因等）抗逆转基因植物（生物的抗性基因）转基因改良植物（如通过导入含赖氨酸多的蛋白质的合成基因或者改变氨基酸代谢中某种酶的活性来提高粮食中赖氨酸的含量）b、动物基因工程成果：提高动物生长速度（含外源生长激素基因的动物）、改善畜产品的品质（含外源肠乳糖酶基因的奶牛是牛奶中乳糖含量减少）转基因动物生产药物（将药用蛋白基因与动物乳腺蛋白基因的启动子等重组，导入动物受精卵获得转基因动物，即乳腺生物反应器）转基因动物作器官移植的供体（导入调节因子，抑制抗原决定基因表达或除去抗原决定基因，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官）c、基因工程药物（利用转基因工程菌生产细胞因子、抗体、疫苗等）d、基因诊断：又称为DNA诊断，原理是DNA分子杂交，工具是用放射性同位素或荧光分子标记的DNA分子探针f、基因治疗：将正常的基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。方法有两类：体外基因治疗，体内基因治疗。16．蛋白质工程基本途径：（1）从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，（2）根据密码子推测出mRNA的核苷酸序列，进而推测出基因中的脱氧核苷酸序列，（3）然后对基因进行改造或者直接人工合基因，最后再通过基因工程实现预期3专题二细胞工程1．植物细胞工程包括两项技术：植物组织培养，植物体细胞杂交2．从理论上讲，生物体的任何一个细胞都具有发育成完整植株的潜能，就叫做细胞的全能性。但是，在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现了全能性，这是基因的选择性表达的结果。3．全能性的大小：植物细胞大于动物细胞；能分裂的细胞大于不能分裂的细胞；受精卵大于生殖细胞大于体细胞4．植物组织培养过程：备注：1、组培需要离体，无菌条件；2、脱分化和再分化均需要生长素和细胞分裂素刺激；3、愈伤组织之前，可以无光照。4、愈伤组织的特点是排列疏松而无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。5.植物组培的培养基的成分是：水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加剂。（加入了凝固剂，是固体培养基）6.动物细胞培养的培养液的成分是：水、无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、动物血清。（不加凝固剂，是液体培养基）7．组织培养的应用：①微型繁殖又称快速繁殖技术②作物脱毒③培育人工种子（在胚状体时期包裹人工种皮）④细胞产物的生产：获得紫草素、人参皂苷只需要培养到愈伤组织⑤单倍体育种：利用植物的花药进行组织培养获得单倍体8．组织培养的原理是细胞的全能性9．植物体细胞杂交过程包括两大阶段：原生质体融合过程，组培过程。所以植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和细胞的全能性。具体过程如下：组培杂种植株原生体融合去壁去壁植物细胞A植物细胞B原生质体A原生质体B杂种细胞脱分化再分化离体的器官、组织或细胞根芽愈伤组织植物体410．酶解法（纤维素酶和果胶酶）去细胞壁，得到原生质体11．诱导原生质体融合的方法：物理法：离心、振动、电激；化学法：聚乙二醇，融合后，得到的融合细胞有3种，AA型，BB型，AB型12．融合成功的标志是再生出新的细胞壁13．植物体细胞杂交优点：克服远缘杂交不亲和的障碍。由于不同生物之间存在生殖隔离，所以不同种的植物之间是无法进行传统杂交的。14．动物细胞工程常见技术手段：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。15．动物细胞培养过程：几个概念：原代培养：1到10代的培养传代培养：10代以后的培养细胞株：10代至50代的这部分细胞细胞系：50代以后的细胞，细胞系的遗传物质发生了改变，具有癌变的特点培养特点：贴壁生长，接触抑制。16．动物细胞培养的条件：①无菌、无毒②营养：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血浆或血清培养基分为：天然培养基和合成培养基，上面的的培养基由于加入了血浆或血清，所以属天然培养基。③适宜的温度和pH④气体环境：95%的空气和5%的二氧化碳，二氧化碳能维持培养液的pH17．动物细胞培养技术的应用：获得生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等）；获得皮肤细胞进行皮肤移植；检测有毒物质；进行细胞生理等方面的研究；动物基因工程的后续手段18．动物细胞培养的原理是细胞的有丝分裂。19.核移植种类：胚胎细胞核移植和体细胞核移植。20．用核移植的方法得到的动物，称作克隆动物胰蛋白酶细胞悬液液动物胚胎或幼龄动物组织10代细胞50代细胞胰蛋白酶521．核移植过程：将供体细胞的细胞核（或者整个细胞）注入到去核的卵母细胞中（该细胞处于减数第二次分裂中期，属于次级卵母细胞）；用物理或化学方法激活受体细胞并培养成早期胚胎；胚胎移植到受体雌性动物子宫中发育22．核移植的典型代表是克隆羊多莉,绝大多数性状（如性别等）都和提供核的那只羊一样，但不能说完全一样，因为次级卵母细胞的细胞质中有线粒体，其上也有基因，也能控制性状。23．核移植的原理是动物细胞核的全能性24．动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性25．动物细胞诱导融合的方法：A．灭活的病毒、B．物理法：离心、振动、电激；C．化学法：聚乙二醇，26.单抗的制备过程：杂交瘤细胞的特点：既能大量（无限）增殖，又能产生专一的抗体单克隆抗体的特点：特异性强，灵敏度高，并可能大量制备。实际应用：①作为诊断试剂，识别各种抗原物质的细微差别，跟特定抗原发生特异性结合，用于诊断疾病和病原体鉴定；②用于治疗疾病和运载药物，可制成生物导弹（将单克隆抗体与放射性同位素、化学药物或者细胞毒素相结合，利用单克隆抗体将这些药物定向带到癌细胞处，杀死癌细胞，这样既不损伤正常细胞，又减少了药剂量）三、胚胎工程1、胚胎工程包括胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养、体外受精。2、精子发生地点：睾丸时间：从初情期开始，精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂；变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。[线粒体为精子运动提供能量]3、卵子发生地点：卵巢时间：在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围]，减一分裂在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精；减二分裂是在受精过程中完成的。4、精子和卵细胞发生的起始时间不同，是两者发生上的重要区别5、排卵是指卵子从卵泡中排出，卵子不是卵细胞，可能是初级卵母细胞（如马、犬），也可能是次级卵母细胞（如猪、羊）效应B淋巴细胞骨髓瘤细胞灭活的仙台病毒诱导筛选杂交瘤细胞筛选W体内培养体体外培养66、受精：（体内受精的场所是输卵管）精子获能：精子在雌性动物生殖道发生生理变化，获得受精的能力（不是能量）卵子的准备：排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力7、受精阶段：（卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵黄膜）a顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。b透明带反应：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入，在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障]；c卵黄膜的封闭作用：精子外膜和卵黄膜融合，精子入卵后，卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障]；d形成原核：精子尾部脱落，原有核膜破裂并重新形成雄原核，同时卵子完成减二分裂，形成雌原核（同时释放第二极体）8、卵细胞受精的标志是在卵黄膜和透明带的间隙能观察到两个极体（第一极体和第二极体）；受精完成标志是雌雄原核融合成合子。9、胚胎发育过程：受精卵→卵裂→桑椹胚(32个细胞左右的胚胎，之前所有细胞都属全能细胞)→→滋养层细胞→胎膜和胎盘囊胚→内细胞团(ICM)→原肠胚→组织、器官、系统的分化→幼体注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化10、卵母细胞的采集和培养：对体型小的动物用促性腺激素处理，从输卵管冲取卵子对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞11、精子的采集：假阴道法、手握法和电刺激法；12、精子获能：对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法（放入人工配制的获能液中）；对牛、羊等精子用化学法（放在肝素或钙离子载体溶液中）13、受精过程：精子和卵细胞在培养液小滴内共同培养一段时间，然后完成受精14、胚胎的早期培养：a、培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等[注意与动物细胞培养液成分的比较]；其它培养条件类同与动物细胞培养b、当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。15、胚胎移植中胚胎的来源可能是转基因、核移植、体外受精获得的胚胎。这些胚胎必须移植给受体才能获得后代16、、胚胎移植的程序：对供、受体母牛(健康，正常的生殖能力)进行选择，用激素进行同期发情处理；对供体母牛用激素做超数排卵处理；选择同种优秀公牛配种或人工授精[有性生殖过程]；对胚胎进行收集[此时胚胎处于游离状态]；对胚胎进行质量检查[此时胚胎应发育到桑椹胚或囊胚]；7胚胎移植[或冷冻保存]检查受体母牛是否受孕；产下胚胎移植的犊牛。16、胚胎分割：用机械方法将早期胚胎切割成2、4、8等分，经移植获得同卵双胎或多胎的技术17、胚胎分割基本过程：选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。注意：内细胞团要均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育18、、胚胎干细胞的含义：由早期胚胎[囊胚]或原始性腺[胎儿]中分离出来的一类细胞，又叫ES或EK细胞