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1[专题一]第一节1、基因工程的概念基因工程是在DNA分子水平上进行，又叫做DNA重组技术。优点包括目的性强、定向改造生物的性状、克服远源杂交的不亲和性。2、基因工程的基本工具包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体3、限制性核酸内切酶（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：形成两种形式DNA片段末端：黏性末端和平末端。4、DNA连接酶的功能是缝合两个DNA片段之间的磷酸二酯键，与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。5、载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）载体包括质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒，主要来自细菌，它是一种裸露的、结构简单的双链环状DNA分子。第二节1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达2、目的基因的获取（1）目的基因是指:编码蛋白质的结构基因（2）目的基因的来源包括从自然物种直接分离获得，人工合成获得。主要是人工合成。（3）基因文库包括基因组文库和部分基因文库（4）PCR技术扩增目的基因1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。2）目的：获取大量的目的基因3）原理：DNA双链复制4）过程：第一步：加热至90～95℃，DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，Taq酶从引物起始进行互补链的合成。5）特点：指数形式扩增6）材料：目的基因的两条链，引物、Taq酶、四种脱氧核糖核苷酸3、基因表达载体的构建基因表达载体的组成包括启动子、目的基因、终止子、标记基因。其中启动子：是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。4、将目的基因导入受体细胞_（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：2将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，促进感受态细胞吸收DNA分子。（3）筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。4、目的基因的检测和表达DNA分子杂交(DNA-DNA)技术，检测目的基因；DNA分子杂交(DNA-RNA)技术检测转录出mRNA；抗原—抗体杂交技术检测翻译成蛋白质；接种实验进行个体生物学水平的鉴定1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物（生物反应器）。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。4.基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。第三节1、蛋白质工程的概念蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）2、蛋白质工程的程序[专题二]第一节1.细胞工程是通过细胞水平和细胞器水平操作，定向改变细胞内的遗传物质，分为植物细胞工程和动物细胞工程1.细胞全能性的概念：细胞具有发育为完整生物体的潜能。根本原因是细胞具有本物种全部遗传信息。不同细胞的细胞全能性的大小是不同的，一般依次是受精卵生殖细胞植物体细胞。植物细胞、动物细胞核具有全能性。2.细胞分化：一个细胞通过分裂分化成一群形态、结构、生理功能具有稳定性差异的细胞群（组织）的过程。具有持久性和不可逆转性，根本原因是遗传信息在不同时间和空间中表达（基因选择性表达）。3.植物组织培养技术（1）流程图（2）条件：离体无菌、营养物质、激素、适宜温度、PH、阳光、蔗糖（维持渗透压、提供营3养）4.植物体细胞杂交技术（1）概念：用两个来自不同物种植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。(2)植物体细胞杂交流程图（3）去细胞壁的方法是酶解法，用纤维素酶、果胶酶。融合的原生质体类型有3种，要选择出杂种原生质体，诱导融合的方法包括物理方法（离心、振动、电刺激）、化学方法（PEG），新细胞形成的标志是新细胞壁的形成。获得细胞产物，杂种细胞培养到愈伤组织，获得杂种植株，要经过植物组织培养技术。技术优点是克服远缘杂交不亲和性。（4）杂交细胞出现的标志是新细胞壁的出现4.植物细胞工程的实际应用包括三大应用：植物繁殖新途径（微型繁殖、作物脱毒、人工种子），作物新品种的培养、细胞产物工厂化（1）微型繁殖保持优良品种的遗传特性、高效快速地实现种苗的大量繁殖（2）作物脱毒常取根尖、茎尖进行组织培养获得（3）人工种子的结构包括人工薄膜、胚状体或不定芽或顶芽或腋芽（4）作物新品种的培养包括单倍体育种和突变体的利用。单倍体育种的特点是后代稳定遗传,都是纯合体;明显缩短育种年限第二节1.动物细胞工程包括1）动物细胞培养技术(基础）2）核移植技术3)动物细胞融合技术2.动物细胞培养(基础）(1)概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖(2)动物细胞培养流程图41）取材：动物胚胎或幼龄动物个体的器官或组织，细胞分裂能力强单细胞获取：胰蛋白酶、胶原蛋白酶2）相关问题细胞贴壁：贴附在瓶壁上的现象接触抑制：贴壁的细胞相互接触时，细胞停止有丝分裂原代培养：1-10代，遗传物质没有改变传代培养：10代以后，50代后细胞继续分裂的可能发生基因突变获得不死性，遗传物质改变（3）动物细胞培养的原理:细胞有丝分裂，结果：获得细胞群（4）动物细胞培养的条件无菌、无毒（抗生素）（定期更换培养液，清除代谢废物）营养：糖、氨基酸、生长因子、无机盐、微量元素（血清、血浆）温度和pH：36.5±0.5℃，7.2---7.4气体：95%空气，5%𝐂𝑶𝟐（5）动物细胞培养技术的应用1）制备：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。3）用于检测有毒物质4）用于生理、病理、药理等方面的研究，3、动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植的类型可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞质激发体细胞核的全能性。（3）体细胞核移植的大致过程如右图：原理是:动物体细胞核具有全能性,“多莉”是无性繁殖的结果.其遗传特性与白绵绵羊更相似（4）体细胞核移植技术的应用：①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量；③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。4.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。(2)动物细胞融合的流程图如右1)诱导细胞融合的方法有物理法(离心、振动、电激)、化学法(PEG)、生物法(灭活病毒)（灭活病毒法动物细胞才有）52)杂交细胞形成的标志是出现单核3)技术基础是动物细胞培养技术,用胰蛋白酶分散细胞（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性5.单克隆抗体（1）抗体：一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。由浆细胞合成分泌,与核糖体、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器有关（2）单克隆抗体通过动物细胞融合技术制备,由杂交瘤细胞合成分泌,优点是大量制备、灵敏度高、特异性强(3)单克隆抗体制备的原理1)利用已免疫的B淋巴细胞能合成分泌抗体2)利用骨髓瘤细胞在体内体外均能大量繁殖3)通过动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞4)杂交瘤细胞既能合成分泌单抗抗体也能体外大量繁殖(4)流程图如右1)小鼠免疫,目的使小鼠产生了浆细胞；2)提取B淋巴细胞、骨髓瘤细胞；3)常用灭活病毒诱导细胞融合4)选择培养基上筛选出融合的杂种细胞5)2次专一抗体阳性检测6)体外培养\体内培养7)提取大量的单克隆抗体。（5）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（6）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。[专题三]胚胎工程胚胎工程的概念：(1)包括的主要技术有体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养技术(2)操作对象:早期胚胎\配子第一节1.精子的发生(1)精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂；变形形成精子(2)精细胞变形为精子,细胞结构的变化顶体(高尔基体)头部(细胞核)尾部(中心体)线粒体鞘(线粒体)等2.精子获能3.卵子的发生(1)在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞,形成卵泡.减数分裂第二次分裂是在受精过程中完成的。形成一个卵子和三个极体.(2)排卵(不成熟的卵)(3)排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减数分裂第二次分裂中期才具备受精能力(4)获能精子与减数分裂第二次分裂中期卵子受精,标志是出现两个极体(5)受精过程的反应包括顶体反应、透明带反应（防止多精入卵）、卵细胞膜反应。4.早期胚胎发育(1)胚胎发育的过程包括受精卵、卵裂期胚、桑椹胚、囊胚、原肠胚6(2)胚胎移植一般采用桑椹胚\囊胚(3)囊胚包括外胚层、内胚层、囊胚腔,由内细胞团细胞,滋养层细胞组成.内细胞团将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘.原肠胚包括外胚层、内胚层、原肠腔.5.胚胎的早期培养：。(1)培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等(2)当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。第二节1.体外受精(1)卵母细胞的采集和培养:促性腺激素处理、超数排卵、冲卵、活体采卵,培养到减数分裂第二次分裂中期(2)精子采集和获能：通过假阴道法、手握法、电刺激法采集精子,采用培养法和化学诱导法诱导精子获能.(3)体外受精(4)胚胎的早期培养,一般在桑椹胚、囊胚进行胚胎移植.第三节1.胚胎移植概念：将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程.是胚胎工程最后一道工序.2.意义:可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力3.胚胎移植的生理学基础：同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的（对供体和受体进行同期发情处理）；早期胚胎形成后处于游离状态，为胚胎的收集提供可能；受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应；移入受体的供体胚胎的遗传特性孕育过程中不受影响。4.流程图如右5.胚胎移植的程序：对供、受体母牛进行选择，用激素进行同期发情处理；对供体母牛用促性腺激素，做超数排卵处理；选择同种优秀公牛配种（有性生殖过程）；对胚胎进行收集（此时胚胎处于游离桑椹胚或囊胚状态）；对胚胎进行质量检查；胚胎移植（或冷冻保存）；检查受体母牛是否受孕；产下胚胎移植的犊牛。6.胚胎分割概念：用机械方法将桑椹胚或囊胚的内细胞团切割成2、4、8均等分，经移植获得同卵双胎或多胎的技术（可看作是动物无性繁殖或克隆）7.胚胎干细胞的移植（1）胚胎干细胞的含义：由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，又叫ES或E