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一、TALEN技术原理TAL效应因子（TALeffector,TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（Xanthomonassp.）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。这些TALE通过细菌III类分泌系统（bacterialtypeIIIsecretionsystem）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。TALEN技术的原理并不复杂，即通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复（HDR）或非同源末端连接途径（NHEJ）修复过程完成特定序列的插入（或倒置）、删失及基因融合。TALEN技术的核心原理就是在同一个蛋白（TALEN）上有序地实现引导进入细胞核、靶位点DNA的特异性识别和靶位点DNA的切割这三个不同的功能，在具体操作中，例如在实验室条件下，实现TALEN的关键就在于完成DNA的特异性识别功能。缺陷在基因打靶的过程中出现了一些脱靶的现象，所以有人推测TALEN可能像锌指酶一样存在这依赖上下文效应，临近的重复氨基酸发生了相互作用，从而影响了重复可变双氨基残基的识别特异性。二、ZFN技术原理锌指核酸酶（Zinc-fingernuclease,ZFN）又名锌指蛋白核酸酶（ZFPN），它是一类人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA结合域（zincfingerDNA-bindingdomain）与限制性内切酶的DNA切割域（DNAcleavagedomain）融合而成。研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。此外，通过将锌指核酸酶技术和胞内DNA修复机制结合起来，研究者还可以自如地在生物体内对基因组进行编辑。ZFN技术可用于基因组编辑。针对目的基因序列设计并合成ZFN后，使之对DNA进行特异性切割，从而形成DNA双链断裂区（Double-StrandedBreaks,DSB）；通过破坏非同源末端链接（non-homologousendjoining,NHEJ）使目的基因失活，或借助同源重组（homologousrecombination,HR）等方式完成DNA的修复连接，可以使断裂的DNA双链重新黏合。将以上两步结合起来便可以完成一般的基因组编辑操作。ZFN缺陷FN技术虽然简易实用，但也具有一定缺陷。ZFN对DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化，并且需要至少一个识别单元结合DNA。DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但由于ZFN剪切的过程并不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段仍然受到现有生物学领域研究手段的限制，因此在细胞内部操作的精确程度和后果都较难预料。如果ZFN引起相关基因突变，则可能会导致一系列意想不到的后果，在与人体相关的应用领域，甚至可能引发癌症。另外，ZFN作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。并且到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（invitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。而直接向患者体内导入相关ZFN元件进行基因编辑处理则具有较大的潜在风险，且效率不高。三、CRISPR/Cas系统工作原理CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型缺陷CRISPR/Cas技术摆脱了合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块的繁琐操作，其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术的DNA识别模块的构建过程，且毒性远远低于ZFN技术。然而CRISPR/Cas技术也有上下文依赖性，目前只能应用于上游有PAM序列的靶位。NgAgo原理河北科技大学生物科学与工程学院韩春雨团队的研究表明，来自格氏嗜盐碱杆菌的一种Argonaute蛋白作为一种核酸内切酶，在向导DNA的引导下，能够在人体细胞中进行基因组编辑。相较于Cas9-sgRNA，NgAgo-gDNA具有更大的优势，规避了令人头痛的脱靶效应，且向导设计制作简便，可编辑基因组内任何位置，对游离于细胞核内的DNA具有更高的切割效率。该科研成果找到了对基因组位点编辑范围更广的基因编辑工具。该工具完全不同于以RNA为向导的CRISPR/Cas9基因编辑技术，这种从古细菌来源的Argonaute，利用短链DNA作向导，真正实现了对基因组的任意位置进行切割，将基因编辑的可能性推入了更广泛的境地。缺陷NgAgo的缺点其实是很明显的：只能切割ssDNA和具有负超螺旋构象的DNA（SCDNA，比如质粒），对于线性化双链DNA是没有切割活性的。这说明：一，NgAgo无法用于dsDNA在体外温和环境下的编辑处理，因此很难用于开发相关的体外分子生物学工具，这比起Cas9是一大劣势；二，在分裂生长不迅速的细胞中，基因组上ssDNA的暴露有限，基因组DNA的SCDNA比例不高，因此NgAgo很有可能也无法进行有效编辑。此外，在生物医疗应用中，向人类细胞中导入外源DNA是很忌讳的，CRISPR-Cas9-sgRNAcomplex导入人体细胞后不会在细胞中长期存在，而NgAgo的gDNA导入细胞后可能会被整合到基因组上，进而带来ethicissue，这一点也是不能忽略的未来发展趋势ZFN、TALEN、CRISPR/Cas和NgAgo系统都是非常有力的转化工具，对生物学研究和个性化医疗（personalizedmedicine）都能够起到革命性的影响和促进作用。实际上，这些新兴的技术极大地拓展了我们对模式生物的处置和研究能力，也为治疗遗传性疾病，纠正遗传错误提供了一种平台。不过要充分发挥这类技术的潜力，还有很多问题和困难需要解决和克服。其中最主要的问题就是每一种技术平台的特异性问题。在不久的将来，能够全面识别脱靶位点的高通量筛查技术可以帮助我们更清楚地认识每一种技术平台的特异性问题。