生理盐水压力对两个水稻品种种子的发芽,抗氧化反应以及脯氨酸含量的影响

生理盐水压力对两个水稻品种种子的发芽，抗氧化反应以及脯氨酸含量的影响我们调查了两个水稻品种，一个是耐盐的”东进”，一个是盐敏感“KM”。在萌发和幼苗阶段我们进行了盐渍水培研究。在氯化钠抑制萌发方面“KM”比“东进”更为严重。如果增加盐浓度会在更大程度上阻止水稻的生长。此外,“KM”的叶子显示出，KM的脂质过氧化作用和钠离子的积累在相同的盐压力下比东进多。而东进的本构的活动和盐诱导超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.1.1)以及抗坏血酸盐过氧化物酶高于“KM”,而东进只有过氧化氢酶活动强度略高。叶片的脯氨酸含量和氯化钠浓度之间的正相关关系在“KM”表现更为明显。然而,东进的种子发芽力在高氯化钠时较高，并且能积累更多的脯氨酸。这些结果表明,耐盐的东进幼苗可以归因于叶子中接累了较少的氯化钠。这大概是由于减少了芽根对于盐离子的吸收以及离子的运输率。最后,我们认为东进之所以有较高的发芽率是因为其种子脯氨酸含量较高。氯化钠是盐水环境中最重要的组成部分。在氯化钠压力下，植物生长缓慢，原因是氯化钠通过影响植物代谢的几个重要的方面，从而使其生长缓慢。比如植物的蒸腾作用，植物对光照吸收，植物的呼吸作用和二氧化碳的同化作用，细胞的生长和分裂，以及植物激素的平衡，氮含量，代谢酶的活性水平，水的供应，离子的摄取，和渗透压的调节等等。盐的浓度的大小也能在种子发芽期间引起众多破坏，比如种子和繁殖体的损坏。这些不同的环境压力下造成的消极影响，我们假定有一部分是由于生成的活性氧（AOS）抑制即抵御他们造成的。其中AOS包括超氧阴离子（02），羟基自由基（9OH），过氧化氢（H2O2），和单线态氧（102）。在增加AOS的过程中，植物体本身也有正常的有氧代谢，似乎这个过程的发生是针对所有非生物胁迫，例如寒冷，重金属离子，干旱，和盐胁迫等。AOS在未淬火或未灭活的情况下可能导致细胞的膜脂质，大分子的蛋白质和脱氧核糖核酸会降解成小分子。植物具有一连串的抗氧化机制，因此能够进行自我解毒以及消除这些AOS。该防御系统机制包括亲水的抗氧化剂（如抗坏血酸，谷胱甘肽），和疏水的抗氧化剂（如O〜生育酚，类胡萝卜素）以及酶如超氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1），抗坏血酸过氧化物酶（AP，EC1.11.1.11），过氧化氢酶（CAT，EC1.11.1.6）和谷胱甘肽还原酶（EC1.6.4.2）。环境压力所造成的阻力通常与有效的抗氧化系统有关联。这些渗透保护剂能够提高细胞质渗透压，在盐浓度或是温度不适宜时候，能在稳定细胞膜中的蛋白质中发挥重要角色，这种渗透保护剂有三个类型：（1）甜菜碱和相关化合物，（2）多醇和糖，（3）氨基酸如脯氨酸。存在一种比较普遍的现象，脯氨酸的积累会使植物暴露于盐或水分压力下，这种现象已经在很多植物品种身上体现出来了。这些植物自身都能够适应渗透胁迫。然而，目前，机械的传授耐盐胁迫是有争议的，一些研究人员推测它是应力损伤的症状，而不是一个指示器的胁迫耐受性。因此，必须更精确地研究在盐胁迫下脯氨酸积累的作用应力。赖斯是一个适度耐盐的作物，这种作物表现出一系列盐度敏感性。目前的研究旨在确定，除了他们的生长，两个水稻品种在萌芽率，膜的过氧化反应，抗氧化剂酶活性，脯氨酸积累量，之间存在的差异。材料和方法植物材料和盐胁迫处理“东进'和'KM'水稻种子分别用0.05％咪鲜胺消毒并且用乳油浸泡24小时，然后用蒸馏水彻底漂洗干净从而能够清除残留的消毒剂。通过对NaCl胁迫抑制萌发的评估，然后两种水稻品种分别随机选取100粒种子，每100粒种子都分别涂上Whatman2溶剂，并保存在9厘米直径的培养皿中。，并在之后加入5毫升蒸馏水和不同浓度的氯化钠溶液。让该种子在30摄氏度的黑条件下发芽六天后，并分别在2,3和5天后，将5ml蒸馏水或一个NaCl溶液（45，90，180或270mM）中加入到培养皿中。发芽的种子的数目每六天记一次数。为了鉴定NaCl胁迫是如何抑制幼苗生长，把种子放置在被蒸馏水浸湿的塑料容器中的金属网上萌发。然后他们被水培在一个受控的生长室（16小时光照，昼夜最高和最低温差在22和30摄氏度之间，70％RH），其中包含0.88mM硫酸钾，1mM的Ca（NO3）2，1mM的（NH4）2SO4，1mM干燥MgSO4，0.25mMKH〜PO4，0.1mM氯化钾，40uM的FeEDTA，10uMH3BO4，1uM硫酸锰，1uM硫酸锌，0.1uM硫酸铜和0.01uM（NH4）6MoO24。用1NHCL将该溶液ph调节至5.8，并每两天进行交换一次。为了分析脂质过氧化作用机制，以及抗氧化酶活性和脯氨酸的积累，要进行叶子样品的收集，称重，并储存在零下70摄氏度环境中。所有实验均独立地至少重复三次。生长测量生长速率测定时，随机选择盐水处理过的水稻种子比较合适。钠离子测定水稻叶子样品在90摄氏度条件下烘干48小时，然后研磨成粉末并装在玻璃试管中。加入相关溶剂，在1NHCl晃动24小时，并用滤纸过滤提取钠离子。钠离子的浓度能够通过电感耦合等离子体光谱发测定。脂质过氧化作用脂质过氧化作用产物是丙二醛（MDA）。将0.5克被研磨成粉末状的叶片用液氮混合5ml冷乙醇萃取。取粗提取物制剂12克并离心20分钟。得到三氯乙酸，硫代巴比妥酸，丁基羟基甲苯的混合物，将上清液试样等分并加热，然后快速将所述混合物在冰浴中停止反应。将冷却的混合物离心，提取的上清液，测定上清液中的分子直径在400，500，和600纳米范围内。硫代巴比土酸反应物质被测定是MDA，其降解产物是脂质。抗氧化酶分析将0.5克冷冻的样品研磨成细粉末，并用液氮混合50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0），乙二胺四酸，0.2mM的抗坏血酸和10％不溶性聚乙烯吡咯烷酮进行萃取。取提取物12克并离心20分钟，并在4摄氏度环境下测定上清液中酶的活动。所有的活动的测定必须在25摄氏度环境下，使用上清液是上述的等分试样。超氧活动氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1）的测定通过麦科德的描述方法测定，混合物由50mM磷酸钾缓冲液（pH7.8），0.1毫黄嘌呤单钠盐，10毫细胞色素C，黄嘌呤氧化酶组成，将此混合物试样等分。抗坏血酸过氧化物酶活性是通过监测和测量抗坏血酸在290纳米下的氧化速率。该反应混合物由50mM钾磷酸盐缓冲液（pH7.0），0.1mM的H2O2，0.5毫抗坏血酸盐，及粗酶的等分试样组成。对过氧化氢酶的活性测定，是根据布卢姆和麦克卢尔的方法，他们的方法通过监测在240nm处的吸光度的降以及H202的氧化程度。反应混合物含有50mM磷酸钾缓冲液（pH7.8），5mM的H2O2。脯氨酸含量脯氨酸含量的测定是根据Bates等人确定的的方法。第一，1'东进'和'KM“100粒种子中的每个种子是在EFT环境下无涂层干燥4周，这个过程在环境温度下进行。其次，以评估叶子中脯氨酸的含量，0.5g的冷冻组织研磨液与液体氮在10ml的3％的磺基的酸的环境下进行充分混合。并且取十二克种子和叶的匀浆在4摄氏度条件下离心20分钟。之后在上清液中加入乙酸和茚三酮，然后煮沸1小时，以此确定脯氨酸的水平。结论氯化钠抑制发芽在不接触氯化钠胁迫的环境下，'东进'水稻种子比'Kurnnam'水稻种子发芽快（如图1所示），但随着盐度的上升，发芽率都在下降。“KM'比'东进的抑制效果更加明显'。例如，在氯化钠胁迫六天后，东进萌芽率仍大于83％。氯化钠抑制增长图1：盐度累积对“东进”（A）和“KM'（B）水稻品种发芽的影响。图2：.盐度对“东进”和”KM”水稻幼苗的鲜重以及嫩芽长度的影响。由于盐的浓度增加，两种水稻的鲜重都下降了，但是，相互对比两种水稻后，发现“东进”生长较少，相比KM抑制作用较大（如图2所示）脂质过氧化作用膜脂过氧化作用的评估要在叶子被氯化钠处理的六天后（图3），把MDA含量作为脂质过氧化作用的指标。在45mM氯化钠溶液中，这两个水稻品种的MDA含量均小幅升高但都有所回落，在90mM的NaCl溶液中。与对照植株相比“东进”的脂质过氧化作用同比增长156％，KM同比增长240％。钠离子浓度随着时间的推移，在氯化钠胁迫下，钠离子的积累东进相比KM更高（图4）。图3：盐度对'东进'和'KM”水稻幼苗的脂质过氧化反应的影响。。图4：盐分中的钠离子的积累对叶“东进〜和〜KM”水稻幼苗的影响。抗氧化酶活性“KM”在SOD本构的构活性上相比东进更高（图5A）。当两品种分别在45和90mM的NaCl溶液中处理后，东进的超氧化物歧化酶活动增加了17％以上，但“KM”几乎没有变化。然而，在90mM的氯化钠溶液中，KM比东进活性高20％。同样，KM本构中AP的活性是在无氯化钠压力时更高（图5B）。分别用45mM氯化钠处理，“东进”和“KM”的AP活性均提高到14％和10％。虽然两个品种的CAT的组成活性几乎相同（图5C），但当在45和90mM的NaC环境下生长，其含量提高13％和15％。图5盐分在氧化物歧化酶（A），抗坏血酸过氧化物酶（B），过氧化氢酶（C）环境下对东进和“KM”水稻幼苗的影响。表1.图6盐度在水稻叶片中有脯氨酸积累的环境下对东进和KM水稻幼苗的积累。脯氨酸积累对于东进水稻品种的种子，脯氨酸含量比'KM脯氨酸含量的计算值高了257%（表1）在叶组织中脯氨酸的积累，东晋比'KM'略高，并在氯化钠压力下分别分别大大增加了，虽然有显着不同的图案（图6所示）。讨论穆罕默德和森1990年提出，发芽抑制是由盐水的渗透胁迫或是有特定毒性的离子造成的。这种反应是种子能够从盐溶液中逆转水分到蒸馏水。在这项研究中，在盐度治疗期，“东进”比“KM”萌发要好（如图1所示），这表明前者能够更加忍耐氯化钠的诱导压力。通常假定，植物对盐度的抵抗力在于它能够限制或阻止钠离子从根进入到枝叶的能力。通常情况下，较高的钠含量破坏了营养平衡和渗透调节，从而使离子具有了特定的毒性（阿兰，1999年）。在这项研究中，在高浓度的氯化钠溶液中，对盐敏感的KM'（如图2所示）叶片上的钠离子的积累相比耐盐性的”东进”而言更加明显。（如图4所示）。这些结果与其他的研究结果一直，表明钠离子浓度和耐盐性之间成反比关系。用NaCl治疗也增大脂质过氧化作用或诱导植物组织的氧化应激（埃尔南德斯等人，1994;Olmes等人，1994;格赛特等人，1996年）。在这里，我们监测了过氧化程度通过测量丙二醛对植物的伤害和当在多不饱和的脂肪酸溶液中产生的膜进行过氧化反应。虽然，在无盐处理情况下，东进和kumnan有着同样水平的丙二醛含量。但是在氯化钠压力下，东进的丙二醛含量会增加（如图3所示）。和东进不同的是，当KM暴露在90mM的氯化钠溶液中，丙二醛含量会明显增加，也许是因为通过抗氧化酶减少了活动。博尔曾经在2003年表明，相比对盐并不敏感的甜菜属，野生耐盐甜菜展现了一个更好的保护机制，它是通过维持较高的本构和损害，以及盐引起的抗氧化酶的活动，如SOD，AP和CAT等。此外，Scandalios在1993年曾报道，SOD和CAT是防止细胞伤害的最有效的抗氧化剂。我们的研究结果表明，东进和KM'相比，SOD和AP的活性均较低（图5由A和B可知），虽然二者均有比例的增加氯化钠的浓度。不过，CAT本构活性两个品种基本类似（由图5c可知）并且经过短暂盐处理后，仅增加东进品种的CAT本构活性增加。因此，基于我们自己的活动进行分析，我们认为，这些抗氧化酶（例如超氧化物歧化酶，AP和CAT）在我们的两个水稻品种对降低盐胁迫的影响不大。为了应对干旱和盐碱胁迫，许多植物物种积累了高水平的脯氨酸，这被认为是一种压力调适功能。然而，由于缺乏相关的一定水平的脯氨酸和耐盐性，也导致了一些植物品种出现结论中所提及到的“这种积累仅仅是损伤的症状，并且不提高耐受性”。这更明显的增加了游离脯氨酸含量盐敏感性比抗盐水稻品种。在这里，我们证明了在这两个品种中脯氨酸的积累都紧密的和氯化钠浓度有关。（如图6所示）这个实验表明，不耐盐植物氯化钠压力下对脯氨酸的积累，不是保护植物自身的一个指标价值，而仅仅是一个后果或症状的应力。与此相反，种子在组成型脯