用于抗癌载药系统的自组装脂质体聚合物复合微球

用于抗癌载药系统的自组装脂质体聚合物复合微球摘要：通过多种物质的连续吸附得到的聚电解质多分子层对于像抗癌药物这种小分子的运载是非常有用的。在本研究中，层层自组装（LbL）纳米结构通过以下方法制得：将天然壳聚糖和透明质酸自然沉积到带负电的固态混合脂质体纳米微球（SLNs）上。阿霉素/葡聚糖硫酸酯的复合物被包在SLNs中。这使得球形纳米微粒的直径在265nm左右，Zeta电位大约为-12mV。纳米微球较为稳定，且表现出阿霉素（DOX）的可控释放。进一步的药代动力学研究表明，相比单纯的DOX以及未经修饰的载DOX-SLNs，LBL功能化SLNs明显提高了循环半衰期，并降低了药物的消除率。综上，结果表明这种具有pH响应外壳和分子靶向性的新型LBL修饰系统，有着作为肿瘤靶向性的药物释放载体的潜质。1.简介固体脂质纳米粒（SLNs）因其能够运载亲水和疏水治疗药物的特性而受到广泛关注。SLNs是结合了聚合物胶体和脂质体微粒优点的胶体载体。它们拥有极好的生物相容性，延展性和稳定性，有着高载药率。然而，SLNs的使用总是和突释以及体内的过早释放联系在一起，主要是因为微粒总是倾向于结晶，使得药物从内核中释放出来。此外，通过网状内皮组织（RES）的活动，SLN基结构会很迅速的从内循环中除去。如果想用这类纳米微粒有效的运输抗肿瘤药物，那么通过制备出一种简单定制，经过表面修饰的控释运载系统来克服这些缺点是相当有必要的。一种表现出良好性质的新系统是利用带有相反电荷的聚合物层层自装载（LBL）形成的多层聚电解质（PEM）涂层。这种聚电解质自沉积的方法作为功能化微粒表面或制备核-壳结构微粒的新方法。PEM在药物运载领域中可以运用于许多治疗方法中。越来越多的证据表明，LBL结构能够延长血液循环，并且对肿瘤间隙的被动扩散和渗透有促进作用。另外，因为层状材料本身的靶向性质，这些结构的肿瘤靶向能力也得到了提升。这种核-壳微球的另一个关键优点包括粒径，高载药率，可控药物释放，以及也许最重要的，可调节的较长的体内血液循环。到现在为止，有关LBL薄膜在载药和体内肿瘤区域靶向性的应用的检测的研究还很少。而且，现在还没有研究是有关能否得到带电高分子在载药和混合SLNs上自然沉积的。在本研究中，我们使用LBL技术来制备稳定的核-壳微粒，使我们能够结合SLNs和PEM的优点。我们设计了三种运载体系：载阿霉素SLN（DOX-SLNs），载阿霉素/葡聚糖硫酸盐混合SLN（DOX/DS-SLNs），LBL覆盖DOX/DS-SLNs（LBL-DOX/DS-SLNs）。天然壳聚糖（CS）和透明质酸（HA）作为一对天然可降解生物高分子，有着很好的生物相容性和生物可降解性，可以作为LBL结构中的层状覆盖材料。为了研究载药系统的适宜制备方法，我们评估了理化参数，并进行了体外释放实验，细胞毒性实验和一些药代动力学实验。2.材料及方法2.1材料2.2LBL修饰SLNs的制备SLNs用热均一法进行制备。通过对脂质体和表面活性剂电位的分析，我们认为Compriol888ATO，卵磷脂和吐温-80是最适合SLN制备的。简单地说，300mg的Compriol888ATO和30mg卵磷脂在10℃下熔化，这个温度高于脂质体的熔点，以保持透明的溶液。水相的表面活性剂是将200μL的吐温-80溶于10ml蒸馏水中，然后加热到油相的温度。加热的水相加入到油相中并使用Ultra-Turrax®T-25均质机分散均匀（13500rpm，3min）。得到的粗状乳液使用探头超声仪超声乳化（90%振幅，3min）。通过冰浴降温热的纳米乳液得到SLNs。DOX-SLNs是通过加入10%w/w的药物在油相中得到的。DOX/DS-SLNs是通过相似的方法制得的，但有些细微的改变。DOX在DS溶液中低速（200rpm/min）搅拌2h孵育。同时将这部分水相（加热到60℃）和水相表面活性剂加入油相中。其他的步骤与上段描述的过程相同。DOX/DS复合物分散在SLN内核中。为了制备层层自组装DOX/DS-SLNs，我们用不同体积比的带正电的CT溶液来包覆带负电的DOX/DS-SLN，然后将带负电的HA溶液加入带正电的CT-SLNs，轻微震荡混合物，孵育1h，制得LBL-DOX/DS-SLNs。（图1）2.3粒径，Zeta电位和多分散性的测量我们使用动态光散射法来测定粒径，多分散系数（PDI）和ζ电位。通过使用Nano-S90Sizer，我们在固定衍射角为90°进行测量。用蒸馏水讲SLN分散液进行适当稀释（比原浓度小50倍，大约为500μg/ml），然后再25℃测量。水相动力学粒径通过Stokes-Einstein方程确定。ζ电位和PDI使用由制造商提供的NanoDTS软件（6.34坂本）确定。每个样都经过三组测定，每组十次。2.4形态分析不同配方的微球形貌分析是通过投射电子显微镜（TEM）在100kV加速电压下得到。将一滴SLN滴在有碳膜覆盖的铜网上。当微粒贴附于网上的时候，使用磷钨酸（2%，w/v）进行负染色。铜网置于适当的红外光下进行干燥，然后再显微镜下成像。2.5物理性质我们使用差示扫描量热法（DSC）研究样品的热行为。DSC记录是以10℃/min的升温速度从40℃到250℃。实验在流速为50ml/min的流动氮气氛围内进行。2.6载药率载药率通过使用离心式超滤装置超滤得到。药物浓度通过标准比色法得到。为了评估被包裹的DOX，我们将2mlSLN分布在超滤装置中（5000rpm，10min）。在收集到滤液后，最终的载药率是由载药SLN在紫外分光仪中482nm下的吸收光度决定的。2.7体外释放实验我们使用透析袋进行透析实验，来确定DOX-SLNs，DOX/DS-SLNs和LBL-DOX/DX-SLNs中DOX的释放率。每种样品都放在磷酸盐缓冲液中（PBS,pH7.4,0.14MNaCl）。实验在37℃，100rpm摇速下进行。每隔固定的时间，用新鲜介质来替换缓释介质，以模拟无限槽液环境。透析液中DOX的浓度通过分光光度法确定482nm下的吸光度来决定。从SLNs中的释药量将以总含药量的百分比的形式表示，并描绘成跟时间相关的函数。2.8体外细胞毒性实验纯DOX，DOX-SLNs，DOX/DS-SLNs的体外细胞毒性实验使用之前报道的MTT法来确定。简单地说，将1x104MCF-7乳腺癌细胞或A-549非小肺癌细胞种在96孔板上，在37℃下孵育24小时。这些表现出对CD44受体中等接受的细胞，将暴露在不同浓度的DOX和DOX-SLNs下，并在37℃下孵育24小时。然后将细胞用PBS洗涤两次，然后置于含10%牛胎儿血清（FBS）的DMEM溶液中再孵育72小时。再在每个孔中加入100μLMTT（1.25mg/ml），将样品置于黑暗中，37℃反应3小时。随后细胞溶解，加入100μLDMSO溶液甲腊晶体。最后，我们使用酶标仪来测定570nm波长下的吸光度，每个样本测定8次。细胞活性如下计算：Asample/Aconrtol*100%，其中A为570nm下的吸光度。2.9药代动力学实验2.9.1研究协议重约240±10g的雄性大鼠被分为四组，每组三只。大鼠在20±2℃和50-60%RH下检疫生存，实验周期加快到12小时。此协议由韩国岭南大学动物伦理委员会通过。2.9.2给药和血液收集我们在每只大鼠的右股动脉进行插管，在既定间隔下（0.25,0.5,1,2,4,6,8,10,12和24小时）抽取血液样本（0.25ml），同时在左股静脉进行插管，进行纯DOX溶液，DOX-SLNs,DOX/DS-SLNs,或LBL-DOX/DS-SLNs的给药。外科创口立刻在外科缝合线的帮助下进行缝合，用以减轻大鼠疼痛，并延长试验周期。血液被取出后，立刻在13000rpm转速下离心分离十分钟，分离萃取出血清进行进一步研究。2.9.3高效液相色谱法（HPLC）血清样本的制备为了从血清样本中沉淀出蛋白质，我们将150μL的血清和150μL的乙腈搅拌混合30min。上清液在13000rpm转速下离心10min分离，然后样品在真空干燥箱中40℃挥发。残余物再加入到乙腈中混合，离心分离。为了量化每份血清样本中的药物水平，我们将20μL的上清液加入含有一个泵，一个自动采样器和一个连有C18检测的紫外检测器的HPLC系统。移动相组成为甲醇：水：醋酸（50:49:1，pH2.9），流速为1.2ml/min。流出物通过在280nm下紫外吸收强度进行检测。2.9.4药代动力学数据和统计数据分析略3.结果与讨论3.1层层自组装混合SLN的制备聚电解质直接装配在SLN上，得到层层自组装混合SLN。从众多的带电聚合物中，我们选取了带正电的天然壳聚糖（CS）和带负电的透明质酸（HA）作为一对组装物。这些多功能多糖表现出极好的生物相容性和拒水拒油抗污性能，后者可以避免血液中不必要的蛋白质吸收和调理作用。另外，HA可以作为肿瘤细胞中CD44的超量表达的靶向目标。由于PEM沉积物主要由静电作用力，离子强度和电荷强度决定，弱电解质聚合物的结构就至关重要，反过来也会影响pH。因此，我们通过分别调节CS（pKa为6.6）和HA（pKa为4.5）至5.5和7.0来使电荷密度达到最大。对于CS，电荷密度因为氨基的质子化作用而提高，而HA，因为羧基的离子化作用使得电荷密度也上升。SLNs表面的负电荷促进了PEM的可选择性。SLNs首先是通过均一法，在脂质体的熔点之上制备，以保持溶液透明。带负电的SLNs包覆上不同体积比的带正电的CS。虽然在几乎每种CS溶液的装配过程之后微粒的粒径都增长了，但在最后一个条件下微粒粒径减小额（30μL，图2A）。而且，CS溶液于电位的稳定转变联系在一起，从-37mV到+35mV（图2B）。最后两个条件下极小的电位差别表明表面修饰应该在更高的浓度下完成。当CS首先加入到带负电的脂质体微粒中时，静电作用力带来了强相互作用。这使得微粒表面形成聚合物团聚，并随着聚合物的增加而增大尺寸。而此时CS的加入使得微粒表面电位得到中和。但是，在中和或拐点之后，后续聚合物的加入会导致表面电位的强烈反转，产生稳定且更坚硬的更小尺寸的微粒。在最适浓度下，CS会在微粒的表面形成像制服一样的薄层。随后，后续加入的更多的CS会增大微粒的尺寸。第二层（多阴离子的HA溶液）的加入使得微粒尺寸达到大约300nm，尽管最终尺寸为230nm左右（图2C）。由于第二层的沉积带来的厚度上增加的10nm是值得注意的。这个与之前报道的相符，即弱电解质聚合物，如HA，会在前一层沉积层上因为聚合物的扩散作用而呈指数增长。事实上，CS-HA层的增长据我们所知是发生在光滑表面上的。而且，与其他由于电荷的过度补偿而直线增长的其他聚合物组合相比，HA形成了松软的非刚性薄膜。这个行为也解释了由于强静电相互作用，短HA链在长CS链间更易扩散。综上，双沉积层增加了微粒50nm的厚度（从沉积之前的175nm到最后的225nm）。我们同样在整个加入层后观察到较好的均一分散性（PDI约为0.2）。随着不同聚合物交替沉积，微球表面的电荷也在交替变换，这证实了膜层在静电作用力的驱动下层状覆盖。因此，我们证明最终LBL-SLNs表面的电荷可以根据我们的需要进行适当的调配。另外，HA作为最外层，既可以提供靶向性，也可以作为控释释放的一层材料。这种技术的成功表明，为了通过EPR效应，生产合适尺寸的LBL生物药物载体微囊来运输抗癌药物是可行的的。3.2DOX的负载DOX-SLNs和DOX/DS-SLNs是通过在液体混合物中加入10%（w/w）的药物制备而成的。在药物加入SLN内核后，DOX-SLNs和DOX/DS-SLNs在尺寸方面都没有明显的变化。这可能是因为内核的大尺寸。然而，DOX/DS复合物在LBL-DOX/DS-SLNs的加入使得尺寸有些许增大，大约264nm。这可能是来源于DS的影响：CT能够和液体以及DS反应，从而影响了结构，使得尺寸增大。虽然在加入DOX之后，SLNs的表面电荷从-36.9±0.7上升到-10.7±0.5，但是这种转变并没