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摘要：项目研究内容和意义简介（限400字）：RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是由双链RNA介导的序列特异性的mRNA降解所致的转录后基因沉默过程。RNAi技术可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的筛选。本课题拟采用RNAi及胚胎干细胞体外定向分化技术，将我室新克隆的精子发生相关基因znf230的siRNA通过慢病毒（Lentivirus）系统引入小鼠胚胎干细胞，体外模拟精子发生过程，而在细胞水平上研究znf230基因表达受抑后对生精的影响，同时结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查，以期全面研究该基因的功能。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1.项目的立项依据（附主要的参考文献目录）人类基因图谱解码已经完成。进入功能基因组学时代后，疾病相关基因以及重要功能基因的分离、定位、克隆表达已日益加速。而随着新基因的分离与鉴定，对这些基因的功能进行系统的研究将成为这一时期的主要任务。因此，建立或开发新的或实用的基因功能研究技术平台具有重要意义。在功能基因组研究中，酵母杂交系统、DNA芯片、反义RNA、基因敲除(geneknock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。其中基因敲除虽是基因功能研究的经典技术[1]，但由于外源及靶DNA发生同源重组的几率极低，重组体的筛选及检测即成为该技术的瓶颈，难以适应大规模的基因功能研究。近年来发展起来的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术作为特异性抑制基因表达的方法，已成为生命科学领域研究的热点。其优点是可以简便地制备特定基因缺失表型的个体，较快捷地研究目的基因的功能，并使系统性、高通量功能基因筛选成为可能。RNAi现象首先在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中被发现。它通过双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导的同源靶mRNA的特异性降解，在转录后水平使基因沉默(PostTranscriptionalGeneSilencing,PTGS)[2,3]。RNAi技术现已成功运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中[4,5]，而在哺乳动物细胞内转染21-25nt长度的siRNA也可以诱导特异性的基因沉默[6]，虽然这种效应具有瞬时性。目前，多个研究小组[7-10]已将靶向特异基因的shRNA表达质粒导入细胞，在聚合酶Ⅲ依赖性H1或U6启动子控制下获得siRNAs的持续表达并导致了靶基因特异、持续的下调，这为RNAi用于长期功能缺失型研究提供了新的思路。然而，目前在RNAi应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决，如：1)shRNA表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的RNAi效应，但多数仍呈瞬时性，且受到转染效率、细胞类型等因素的限制，难以获得长期的“knockdown”效应。2）并非所有的组织或细胞的靶基因对RNAi敏感；某些基因的表型鉴定本身就存在困难，一定条件下需用特定的基因传递系统在模型中加以证实。3）目的基因序列上siRNA模板的选择无统一标准。实际操作中往往是试探性的，选择不同序列RNAi效应差别大，抑制率可从0～90％不等。因此，建立高效、稳定长期表达的RNAi传递系统正是该领域目前研究的关键。虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达[11]，但MMLV类病毒自身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。当前，新型第三代慢病毒(Lentivirus)系统正以其高效、稳定的特性在RNAi研究中倍受关注。Lentivirus来源于HIV-1病毒，其宿主细胞范围广泛，包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细胞等，且转基因在生殖系统中可稳定传递[12,13]。Pfeifer[14]等的研究结果表明，Lentivirus介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(EmbryonicStem,ES)体内、外分化过程中表达，将Lentivirus感染的ES细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，发育的新生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。Tiscornia[15]等将沉默GFP的Lentivirus感染GFP阳性转基因鼠卵细胞，发现新生鼠体内GFP荧光蛋白的表达明显降低。Rubison[16]等运用CD8/CD25siRNA的Lentivirus载体转染鼠ES细胞，生成了“knockdown”转基因鼠，其效应维持长达30天之久并可传递下一代，充分显示了该方法的优越性。精子发生是一个复杂的多阶段的细胞分化过程，涉及生精细胞的生长、分裂、分化和信号传递等，要求一系列基因表达的精确调控[17,18]。这些基因的异常将导致精子发生障碍，表现为寡精症或无精症。近年来我室分离克隆了一系列可能与精子发生相关的基因[19-22]，目前已初步阐明了这些基因的结构与表达，如ZNF230在无精症患者睾丸组织中无表达，znf230在小鼠睾丸内特异表达且可能在精细胞(spermatid)形成阶段起重要作用[22]。由于生精过程极其复杂，这些基因的调控及其生物学功能尚未明了。为探索此类问题，首先需建立供研究的模型系统。2003年末，ToshiakiNoce研究小组[23]成功地将小鼠ES细胞在体外定向分化成精子。研究中，悬浮培养的ES细胞在BMP4刺激及拟胚体立体空间构型的影响下向原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs)分化，具PGCs性质的ES细胞aggregation移植至裸鼠的睾丸囊中即可发育成成熟的精子。此外，Daley及Geijsen等研究小组[24]也报道了ES细胞体外分化成精子的新进展。基于以上RNAi研究所取得的成果，结合鼠ES细胞体外定向分化新技术，我们设想如能将Lentivirus系统引入小鼠ES细胞使之长期稳定表达、发挥RNAi效应，则可模拟兴趣基因在特定疾病中的异常表达情况，进而确定其功能。因此，可将ES细胞在体外定向分化成精子，即体外模拟精子发生过程，在细胞水平上研究某一精子发生相关基因表达受抑后对生精的影响，以期全面研究该基因的功能。鉴于此，本课题在前期研究工作的基础上，拟运用生物信息学及RNAi载体构建新技术对我室新克隆的基因znf230(GenBankID:AF353167)进行有效siRNA序列筛选、靶位证实，生成高效表达的Lentivirus载体系统并引入小鼠ES细胞，阻断znf230的表达(6个有效的shRNA串联片段使RNAi抑制率至少达90％以上)。在精子体外分化模型的细胞水平上，为了有效地获取精子发生过程中znf230相关基因的表达、网络调控及其功能信息，将结合基因表达谱芯片技术的高通量、快速、敏捷、平行性等特点，对照研究znf230表达被抑后表达谱的变化，以实现高通量的基因功能性筛查；同时运用经典的蛋白组学二维电泳-质谱技术来研究znf230被抑制后的蛋白表达变化，实现对蛋白质的表达进行原位筛查，以期分离鉴定有功能意义的蛋白。目前国内对RNAi的研究刚刚起步，我们利用LentivirusRNAi系统建立的znf230基因功能研究方法，在设计理论与技术上均与国际上的有关研究位于同一起点。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。参考文献1.LockhartPJ,O'FarrellCA,FarrerMJ.It'sadoubleknock-out!Thequakingmouseisaspontaneousdeletionofparkinandparkinco-regulatedgene(PACRG).MovDisord,2004,19(1):101-104.2.ZamorePD,TuschlT,SharpPA,andBartelDP.RNAi:Double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell,2000,101:25-33.3.HammondSM,BernsteinE,BeachD,HannonGJ.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophiacells.Nature,2000,404:293-296.4.RaviS.Kamath,AndrewG.Fraser,YanDong,etal.SystematicfunctionalanalysisofthecaenorhabditiselegansgenomeusingRNAi.Nature,2003,421(16):231-237.5.CarmellMA,ZhangL,ConklinDS,etal.GermlinetransmissionofRNAiinmice.NatStructBiol,2003,10(2):91-92.6.PatrickJ.Paddison,AmyA.Caudy,andGregoryJ.Hannon.StablesuppressionofgeneexpressionbyRNAiinmammaliancells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002,99,(3):1443-1448.7.ThijnR.Brummelkamp,RenéBernards,ReuvenAgami.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCells.Science,2002,296(5567):550-553.8.GuangchaoSui,hristinaSoohoo,lBachirAffar,etal.ADNAvector-basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,99(8):5515-5520.9.汤富酬,杨红波,孟国良等.Cos-7细胞中小发夹RNA介导的RNA干涉.遗传学报,2003,30(4):295-300.10.McCaffreyAP,MeuseL,PhamTT,etal.RNAinterferenceinadultmice.Nature,2002,418(6893):38-39.11.BartonGM,MedzhitovR.RetroviraldeliveryofsmallinterferingRNAintoprimarycells.ProcNatlAcadSciUSA.2002,99(23):14943-14945.12.TomDull,RomainZufferey,MichaelKelly,etal.AThird-GenerationLentivirusVectorwithaConditionalPackagingSystem.JVirol.,1998,72(11):8463-8471.13.ZuffereyR,DullT,MandelRJ,etal.Self-inactivatinglentivirusvectorforsafeandefficientinvivogenedelivery.JVirol,1998,72(12):9873-9880.14.PfeiferA,IkawaM,DaynY,etal.Transgenesisbylentiviralvectors:lackofgenesilencinginmammalianembryonics