甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化及转基因植株的鉴定

1甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化及转基因植株的鉴定摘要：本工作利用已构建的pET(CmPP)质粒为模板，再扩增甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP，然后通过酶切克隆到质粒pBI121中，构建了植物表达载体pBI121(CmPP)，并将其转化到根癌农杆菌LBA4404中。通过农杆菌侵染的叶盘转化法和多重PCR鉴定，获得了阳性CmPP转基因烟草植株。关键词：甲基戊糖梭菌，膜整合焦磷酸酶，农杆菌转化，转基因烟草Tobaccotransformationofthemembrane-integralpyrophosphatasegeneofClostridiummethylpentosumandidentificationofthetransgenictobaccoplantsAbstract:Inthiswork,usingtheconstructedplasmidpET(CmPP)asDNAtemplate,themembrane-integralpyrophosphatasegeneCmPPofClostridiummethylpentosumwasre-amplified,andsubclonedintotheplasmidpBI121byenzymedigestiontocreatetheplantexpressionvectorpBI121(CmPP)thatwasfurthertransformedintotheAgrobacteriumtumefaciensstrainLBA4404.ThroughtheleafdisctransformationbyAgrobacteriuminfectionandmultiplePCRidentification,thepositivetransgenictobaccoplantsofCmPPgenewereobtained.Keywords:Clostridiummethylpentosum,membrane-integralpyrophosphatase,Agrobacteriumtransformation,transgenictobacco21前言膜整合焦磷酸酶（简称膜PPase）是焦磷酸（PPi）储备能量转移和利用的动员蛋白，用以维持阳离子梯度进而帮助细胞在胁迫条件下存活[1-4]，与生物体的逆境适应密切相关[5-10]。膜PPase根据其转运离子的特异性可分为Na+-PPase、Na+,H+-PPase和H+-PPase三个亚家族，其中以Na+-PPase作为膜PPase的进化始祖，它们在高级结构和功能关键残基上具有高度的保守性[11,12]。另外，膜PPase根据其活性是否需要K+激活而总体上可划分为K+依赖型和K+非依赖型两大类[13]。具有H+泵活性的膜H+-PPase广泛存在于包括古生菌、真细菌、植物和原生动物在内的生物三界中，发现最早，研究得最早和最多[2]，特别是近十五年来在构建抗逆生物尤其是植物方面的应用已十分引人瞩目，过表达H+-PPase的各种转基因植物在诸多逆境条件（如高盐、干旱、磷或氮营养亏缺等）下表现出增强的抗性或耐受性[14-20]。相比较，其它两个亚家族PPase（Na+-PPase和Na+,H+-PPase）几年前或最近仅在原核生物（主要是一些极端环境（如高盐、缺氧）下的古生菌和细菌）中发现[3,4]，不仅暗示出它们对原始生物体应对早期地化环境（当前还有遗存）的重要性，同时也一致性印证了H+-PPase对现世植物适应逆境的关键作用。它们具有Na+泵活性和直接的排Na+作用以及在创建抗盐转基因生物的巨大应用潜力。但是，关于它们的功能验证和应用研究目前还几乎没有明确的报道。本工作特地针对人肠道甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP，推测是Na+,H+-PPase亚家族成员），将其基因转化到烟草中以分析它在转基因烟草的抗盐效果，为后续进一步将它应用于主要农作物的抗逆（盐）基因工程打下必要的基础。2材料与方法2.1实验材料植物实验材料：烟草品种为NicotianatabacumXanthi，种子由本实验室提供，取其一个月大的无菌苗叶片作为转化外植体。宿主菌及载体：本工作所用大肠杆菌菌株DH5α、植物载体pBI121、根癌农杆菌LBA4404均为本实验室保存。32.2主要试剂和耗材2.2.1生化和分子生物学试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、DreamTaqDNA聚合酶等购于ThermoScientificFermentas公司。蛋白胨、酵母提取粉等购于生工生物技术有限公司。氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术公司。常用试剂盒如胶纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒，溶液纯化试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒由北京天根公司提供。2.2.2激素与抗生素（1）a-萘乙酸(NAA)：用95%的酒精溶解后，加水定容，配制成0.2mg/mL的母液，用0.22μm滤膜过滤灭菌后于4℃保存。（2）6-苄氨基嘌呤(6-BA)：用2M的氢氧化钠溶解后，加水定容，配制成2mg/mL的母液，用0.22μm滤膜过滤灭菌后保存于4℃。（3）羧苄青霉素(Car)：储存浓度为250mg/mL，称取2.5g的药品溶解在无菌水中，定容到l0mL后用0.22μm滤膜过滤灭菌，保存在-20℃。（4）链霉素(Str)：125mg/mL，将1.25克药品溶解于无菌水中，定容至l0mL后用0.22μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。（5）卡那霉素(Kan)：100mg/mL，称取1g的药品溶解到无菌水中，定容到l0mL后用0.22μm的滤膜小心过滤灭菌，-20℃保存。2.2.3培养基的配制（1）YEB培养基（用于农杆菌的培养）：配制1L，加酵母提取物1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、硫酸镁0.5g，将pH调为7.0，每升固体培养基加20g琼脂粉，高压灭菌后备用。（2）MS培养基（用于烟草的培养），按表4.1配制6种母液：表4.1MS培养基母液的配制母液成分用量（g）定容（mL）每升用量（mL）母液1（50倍）NH4NO38.2510020KNO39.5MgSO4∙7H2O1.85母液2（100倍）无水CaCl23.322410010母液3（100倍）KH2PO41.710010母液4（100倍）Na2∙EDTA0.373100104FeSO4∙7H2O0.278母液5（1000倍）H3BO30.621001MnSO4∙H2O1.69ZnSO4∙7H2O0.86KI0.083Na2MO4∙2H2O0.025CuSO4∙5H2O0.0025CoCl2∙6H2O0.0025母液6（200倍）肌醇201005甘氨酸0.4烟酸0.1盐酸吡哆醇(VB6)0.1盐酸硫胺素(VB1)0.02注：将药品分别用少量蒸馏水溶解后，混匀，加蒸馏水并定容至所需体积；1L培养基中需加入30g蔗糖，固体培养基每升加7g琼脂粉；固体和液体培养基的pH均为5.8。（3）LB（Luria-Bertain）培养基，用于大肠杆菌的培养。配制方法（1L）：称取10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于900mL去离子水中，用5M的NaOH调节pH值至7.0-7.2，用去离子水定容至1L。分装后于121℃高温高压灭菌30min后室温保存，开封后4℃保存。如果是固体培养基则调整pH值后按15g/L加入适量琼脂粉再定容和灭菌。2.3实验方法2.3.1植物基因组DNA的提取参照TIANGEN公司的新型植物基因组DNA提取的试剂盒说明书进行：（1）材料处理：称取100mg新鲜植物组织或干重组织20mg，加入少量液氮研磨充分。把400μLLP1缓冲液和6μL浓度为10mg/mLRNaseA加入到材料中，振荡旋涡1min，在室温下放置10min。（2）加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1min。（3）12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。（4）把1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前已加入无水乙醇）加到离心管中，立刻振荡15sec，混匀，振荡后也许会有絮状沉淀出现。（5）把上一步得到的溶液连同絮状沉淀一起都加一个新的吸附柱CB3中，12,000rpm的转速，室温下离心30sec，将废液倒掉，并把吸附柱CB3放入干净的收集5管中。（6）把600μL的漂洗液PW加入到CB3中（使用前经检查已加入无水乙醇），12,000rpm的转速，室温下离心30sec，将废液倒掉，并把吸附柱CB3放入干净的收集管中。注意：如果漂洗后吸附柱膜依然呈现绿色，要将500μL的无水乙醇加入到吸附柱CB3中加入，12,000rpm的转速，室温下离心30sec，将废液倒掉，并把吸附柱CB3放入干净的收集管中。（7）重复操作（6）。（8）将CB3吸附柱放回到收集管中，12,000rpm离心2min，将废液倒掉。把CB3吸附柱静止放在室温下几分钟，彻底晾干漂洗液。（9）把CB3吸附柱转移到一个干净的离心管中，向吸附柱中央悬空加入适量水。室温下放置2~5min后，12,000rpm离心2min，把洗脱下来的溶液收集到离心管中。2.3.2烟草种子的消毒及无菌苗的培养（1）将适量烟草种子置于灭过菌的1.5mL离心管中，用无菌水冲洗干净；（2）加入适量75%的乙醇，对种子进行表面消毒30s，其间不断用枪头吹吸；（3）用无菌水冲洗一次；（4）向离心管中加入适量10%的双氧水，对烟草种子进行彻底消毒10min，其间不断用枪头吹吸；（5）用无菌水冲洗5次，吸出多余的水，将离心管置于超净工作台吹干；（6）将种子转接到MS基本培养基上培养2~3周，培养条件为：温度26℃，光照强度1500Lux，16h光照/8h黑暗。（7）剩余的种子封装好放于4℃保存备用。2.3.3农杆菌感受态细胞的制备（1）-80℃保存的农杆菌LBA4404解冻后，取少量于YEB培养基(含125mg/LStr)平板上划线，28℃培养2天左右。（2）挑取单菌落接种于3mLYEB培养基(含125mg/LStr)，28℃，180rpm振荡培养过夜。（3）按1:100的比例取过夜培养物接种于新鲜YEB培养基(含125mg/LStr)中，628℃，180rpm振荡培养至OD600=0.45左右。（4）将菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰浴30min，4℃，5000rpm离心5min。（5）用10mL冰冷的0.15mol/L的NaCl溶液悬浮沉淀4℃，5000rpm离心5min，弃尽上清。（6）冰浴中用1mL0.02mol/L的CaCl2溶液（含终浓度15%的甘油）轻轻悬起细胞，即用、或100μL/管分装好后液氮速冻并于-80℃保存备用。2.3.4CmPP植物转化载体的构建2.3.4.1插入片段CmPP(SS)的制备（1）片段CmPPSm的扩增扩增体系如下：组分体积(μL)10×PfuBufferwithMg2+52.5×dNTPMix(2mMeach)4引物CmPP-5Sm(25μM)1引物Tt7Dw-Rv(25μM)1模板：适当浓度的pET(CmPP)质粒1PfuDNA聚合酶（5U/μL）0.5无菌水37.5程序：步骤温度（℃）时间循环数预变性955min1变性9430s1退火4930s延伸725min变性9430s35退火5630s延伸725min最后延伸7210min1胶回收PCR产物，纯化后片段取名为CmPPSm。（2）用SacI完全酶切CmPPSm，胶回收约2.1kb的片段（不要~0.2kb的小片段），取名为CmPP(SS)，作为插入片段。2.3.4.2载体片段pBI121(SS)的制备7（1）将植物载体pBI121转化到大肠杆菌DH5中，摇菌，提取质粒，取1μL用琼脂糖凝胶电泳检测。（2）将植物载体pBI121的DNA用SmaI、SacI双酶切完全（切出来两个片段12.9kb、1.9kb），胶回收约12.9kb的大片段，取名为pBI121(SS)。2.3.4.3连接、转化及鉴定（1）将片段pBI121(SS)和CmPP(SS)进行连接组分体积（μL）pBI121(SS)10（