由苏木素氧化原理谈苏木素染液配制过程中的几个问题

由苏木素氧化原理谈苏木素染液配制过程中的几个问题一、苏木素的氧化反应产物苏木素↓氧化苏木素（为需要的产物，染色的成分。氧化分子中一个羟基成为羰基，形成共轭π键）↓过氧化苏木素（其余的羟基进一步被氧化，共轭π键破坏，发色团破坏，失去颜色）二、苏木素染液配制选用的氧化剂种类、氧化剂使用剂量。1、常用氧化剂的比较半反应氧化还原半反应和标准电极电位氧气（O2）O2+4H++2e－→2H2O1.229氧化汞（HgO）Hg2++2e－→Hg0.851碘酸钠（NaIO3）2IO3－+12H++10e－→I2+6H2O1.195高锰酸钾（KMnO4）MnO4－+8H++5e－→Mn2++4H2O1.507氧化还原半反应和标准电极电位值越大，得电子的能力越强，氧化力越强。氧化能力弱的氧化剂反应速度慢，升高反应体系的温度以加快反应速度，越强的氧化剂的反应速度越快，须控制反应体系的温度使反应速度减慢。2、不同氧化剂的使用剂量根据苏木素氧化反应式可以计算出氧化1克纯苏木素所需要的不同氧化剂量（理论值）。C16H14O6+HgO→C16H12O6+Hg↓+H2O摩尔质量302.28216.61质量1g0.72g6C16H14O6+2NaIO3→6C16H12O6+I2+6H2O+2Na+摩尔质量302.28×6197.9×2质量1g0.2g4C16H14O6+KMnO4→4C16H12O6+4H2O+Mn2++K+摩尔质量302.28×4158.03质量1g0.13g注意：这是理论值，在实际配制染液时，氧化剂的使用量要减少至理论值的1/2量为宜。理由：（1）、我们使用的氧化剂品质多为分析纯的，含量比较保证，而苏木素为天然染料，含量不是很保证，所以氧化剂需减少用量。（2）、配制染液时应刻意保留1/3量的苏木素不被氧化，使之在使用过程中再被氧化，令染液耐用。三、媒染剂的使用氧化苏木素羰基中的氧原子最外层轨道含有孤对电子，能与Al3+++、Fe3+++等金属离子形成外轨型配合物。氧化苏木素通过金属离子与细胞核内DNA双链外侧磷酸基上带有孤对电子的氧原子形成配位键而使细胞核内的DNA着色。媒染剂的使用不但大大提高了氧化苏木素对DNA的上染率，也加强了染液的水洗牢度。媒染剂一般为二价或三价金属的盐或氢氧化物。常用于苏木素染液配制的媒染剂为KAl(SO4)2·12H2O、FeK(SO4)2·12H2O、NH4Fe(SO4)2·12H2O等，也可以用其他的如Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O等可电离Al3+++或Fe3+++的盐作为媒染剂。四、乙酸的使用冰乙酸的作用是降低苏木素染液的PH值，增强DNA着色的特异性，减少蛋白质的非特异性着色。蛋白质分子具有游离的氨基端与羧基端，为两性分子。溶液的PH值高于蛋白质的等电点时，蛋白质羧基端电离时负电，与氧化苏木素的Al3+++结合，引起蛋白质的非特异性染色。当溶液的PH值低于蛋白质的等电点时，蛋白质的羧基端不电离，而氨基端以阳离子形式存在，与Al3+++相斥，氧化苏木素不能与蛋白质结合，减少蛋白质的非特异性染色。五、苏木精染液常见问题的原因分析及解决方法1、苏木精染液表面“氧化膜”与沉淀的形成苏木精染液表面的氧化苏木精与空气中的氧气接触而进一步氧化，氧化苏木精3位羟基被氧化成羰基，羰基氧原子的孤对电子充分暴露在外，更容易进入Al3+++的杂化空轨道形成配位键，使过氧化物形成聚合物。苏木素染液表层过氧化物氧聚合物成片层样，形成“氧化膜”，溶液内部的过氧化物聚合物形成沉淀。解决办法：（1）、避免氧化反应过度引起过氧化苏木精增多。（2）染液加入丙三醇：丙三醇俗称甘油，丙三醇1、2、3位均连有一个羟基（极性基团），羟基中的H原子带部分正电荷，与氧化苏木精分子中的羟基上的O原子（带部分正电荷）形成氢键。丙三醇分子占据了氧化苏木精的羟基旁的位置形成“空间阻隔效应”，有效阻断了Al3+++与O原子形成配位键，使氧化苏木精分子不能聚合，减少了沉淀和“氧化膜”的产生。2、苏木精染液染色能力下降过快。苏木精染液染色能力下降的原因：（1）苏木精染液在使用过程中，因染液中的氧化苏木精浓度逐步降低导致的染色颜色变淡，此属正常现象。（2）染液中的氧化苏木精进一步被氧化成过氧化物，过失去染色能力。根据化学反应平衡原理及化学反应速率理论，苏木精染液配制时，反应物浓度逐渐下降，生成物浓度逐渐增加，氧化反应达到了初步的平衡。但在反应体系中依旧存在低浓度未反应的氧化剂离子（Hg+、IO3－等），在染液使用过程中，染液中的氧化剂继续缓慢的进行氧化作用，使染液中的氧化苏木精苏木精进一步被氧化。染色过程中将自来水带入苏木精染液也是形成过氧化物的重要原因：目前，我国自来水消毒剂常用Cl2（1L水中通过0.002gCl2）。Cl2与水反应生成HClO，ClO－具有很强的氧化能力，将氧化苏木精继续氧化成过氧化苏木精，加速染液“变旧”。使苏木素染液耐用的方法：（1）配制过程中氧化剂的使用量要合适：氧化剂的使用量要减少至理论值的1/2量为宜。目前生产苏木素的厂家很多，苏木素的纯度高低不一。需根据苏木素的质量适当调整氧化剂的使用量。配制结束时染液中依旧存在一定浓度的苏木素未被氧化，以“应付”染液在放置和使用过程中氧化剂的继续氧化反应，尽量减少染液中的过氧化苏木素的生成。（2）配制过程中对温度和反应时间的控制要合适。HgO的最佳反应温度为90~100℃反应5分钟后快速冷却，NaIO3，KMnO4在室温下（25℃）进行氧化反应，如果温度过高，氧化反应将会过快，苏木素被直接氧化成为过氧化物，导致具有染色能力的氧化苏木素浓度低下，导致染色效果差。（3）染色过程中减少自来水带入染液。进入苏木素染液前用蒸馏水洗切片或将自来水尽量甩干再放入染液染色，可有效延长苏木素染液的使用寿命。何细胞涂片用酒精固定不容易脱片？有一个经常发生的现象不知大家曾经仔细观察并思考过原因没有：用95%酒精固定的组织切片与甲醛固定的组织切片有什么不同？酒精固定的组织切片出现胞浆胞核“一边倒”的现象是什么原因？如果把这个问题想清楚了，也会明白为啥细胞涂片用酒精固定不会脱片了“酒精固定的差异在核染色质：不均匀、常不规则聚集在核膜周围，经常会出现核中染色质空白区”也是酒精固定的特点。如果是酒精固定的组织，在组织外周的边缘的细胞会出现一种胞浆胞核向中央“偏向”的现象，特别是一些细胞大的组织，如肝组织等，这种现象会更明显。组织中央就不明显了。这种“偏向”现象在细胞涂片是看不到的