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1第五节生物药剂学研究方法及其进展生物药剂学经过了四十余年的发展，已经成为一门较为系统、完善的药学学科，并逐渐渗透到了药物研究开发、质量评价及临床应用等各个环节。生物药剂学通过研究不同的药物、相同药物的不同剂型在不同个体的体内过程特征与药物效应之间的关系，揭示药物作用规律。常用的研究方法如下：（一）建立药物质量评价方法随着生物药剂学的发展，药品的质量不再局限于药物的化学结构、主药的含量或杂质的限量等基本内容，而应深入考虑到影响药物体内过程的有关性质上，这不仅使药品质量概念有了深化，也由此提出了更加合理的药品质量控制指标与方法。因此，从生物药剂学角度出发，建立相应的药物质量评价方法，能够更好的保证临床用药的安全性和有效性。1．口服固体制剂溶出度与释放度测定方法研究口服固体制剂溶出度与释放度反映了在规定介质中，药物从固体制剂中溶出（或释放）的速度与程度，是评价口服固体制剂质量的重要指标之一。由于难溶性药物的溶出过程是其吸收过程的限速因素，因此溶出度是口服固体制剂质量控制中不可缺少的指标之一，对于研究开发早期的处方筛选、工艺优化中也有着重要意义。口服缓释与控释制剂可较持久地传递药物，减少给药频率，降低血药浓度峰谷现象，并在用药过程中较长时间维持适宜的血药浓度水平，就是通过控制药物从制剂中释放的速度而实现的。因此在口服缓释与控释制剂的研究中，释放度是起决定性作用的质量评价指标。溶出度与释放度测定方法的研究内容，通常包括溶出度测定装置的改进；溶出介质等试验条件的控制；影响溶出度与释放度测定结果的因素考察；体外溶出度、释放度与体内吸收过程相关性考察等。2．微粒靶向制剂的粒径及其分布根据机体不同组织或器官的生理学特性不同，具有不同性质与粒径的微粒在体内的滞留性或通透性也不同，可使药物选择性地聚集于不同部位发挥疗效。因此，微粒的粒径大小直接影响靶向制剂的体内分布，是微粒靶向给药系统质量评价的一个非常重要的一、生物药剂学研究方法2指标。测定微粒粒径的大小及分布的方法有多种，如光学显微镜法、电子显微镜法、激光衍射法、库尔特计数法、Stoke’s沉降法、吸附法等。其中电子显微镜法是应用传统的图像分析方法先拍摄电镜照片，然后逐一测量粒子的尺寸再做统计。而激光衍射法所使用的仪器是激光粒度分析仪，它具有扫描速度快、测定粒子多、代表性强、给出信息量多等优点，与人工测定电镜照片进而计算微粒粒径大小及其分布相比，激光粒度分析仪能更全面、准确地反映出所测微粒的粒径大小。3．手性药物的限量控制常用的合成药物中有40%以上为手性药物，然而药物对映体中往往只有一种对映体有显著药理活性，而另一对映体没有活性或活性很弱，加上在体内的立体选择性结合，导致其体内过程的差异。因此，手性药物的立体化学特征以及体内酶、受体等生物大分子的立体特异性是影响手性药物疗效的重要因素之一。手性药物的质量标准应能充分体现其立体化学特征。选用具有立体选择性的方法对手性药物进行定性鉴别、定量纯度检查，以及定量检测异构体杂质的含量是手性药物质量控制的重要手段之一。随着现代分析技术的不断发展和完善，对手性药物的研究也越来越重视。手性药物的分析方法有很多，如比旋度测定法、手性色谱法（手性HPLC及毛细管电泳等）、手性衍生法等。（二）建立新型给药途径的实验方法传统给药途径与剂型已经不能满足现代医疗需要，黏膜给药及经皮给药等新型给药途径正在迅速发展。开发新的给药方法，需要对药物的体内过程，特别是药物的转运机制及影响药物体内过程的因素，进行准确、详细的研究。在研究的过程中必需选择合适的实验装置与材料，建立正确的研究方法。如经皮给药研究中，需建立体外药物经皮扩散实验方法，用于了解药物在皮肤内透过的过程、研究影响经皮透过的因素和筛选经皮给药系统的处方组成等。鼻腔给药需研究鼻黏膜中酶对药物的降解作用及药物或辅料对鼻黏膜纤毛运动的毒性作用。（三）建立模拟体内过程的研究方法1．药物吸收试验方法药物经给药部位吸收进入体循环的速度与程度是口服药物发挥治疗作用的关键。药物吸收试验主要研究药物在胃肠道的吸收动力学、有效吸收部位、吸收机制、影响吸收的因素等，对剂型的设计、制备工艺的改进、临床给药方案的制定都具有重要的指导意义。常用的评价药物吸收的研究方法有体外法、在体法和体内法三种[3]。体外研究方法3通常采用离体实验模型，有组织流动室法、外翻肠囊法、外翻环法及细胞培养模型。其中，Caco-2细胞模型法广泛应用于研究药物的吸收机制，预测各种途径药物的转运，目前已成为药物吸收研究的一种快速筛选工具。在体研究方法通常采用原位实验模型，主要有肠道灌流法、肠道血管灌流技术、肠肝血管灌流技术等。体内法通常是在口服给予药物后，测定体内药量求算药物动力学参数，来评价药物的吸收速度和程度。2．血浆蛋白结合试验方法进入血液中的药物，一部分与血浆蛋白成为结合型药物，另一部分在血液中呈非结合型的游离状态存在。通常只有游离型药物才能透过毛细血管向各组织器官分布，因此药物的血浆蛋白结合是影响体内分布的重要因素。血浆蛋白结合试验主要研究药物与血浆蛋白结合的机制、潜在的结合相互作用、血浆蛋白结合对膜转运的影响等内容。在新药的血浆蛋白结合研究中，主要是测定血浆蛋白结合率。研究药物与血浆蛋白结合的方法主要有平衡透析法、超滤法、超速离心法、凝胶过滤法等[4,5]。根据药物的理化性质及实验室条件，应选用一种方法至少进行3个药物浓度（包括有效浓度在内）的血浆蛋白结合率试验，每个浓度至少应重复试验3次，以了解药物的血浆蛋白结合率是否具有浓度依赖性。3．药物代谢试验方法药物进入机体后，在体内酶和体液环境作用下，可发生一系列化学反应，导致药物化学结构上的转变，这就是药物代谢过程。药物代谢不仅影响药物作用的强弱和持续时间的长短，而且还会影响药物治疗的安全性，具有重要的现实意义。药物代谢试验主要研究药物代谢途径、代谢速率、代谢过程的影响因素及其影响规律，代谢与药物活性和安全性的关系等。通过对药物代谢的研究，掌握药物代谢规律，对于设计更合理的给药途径、给药方法、给药剂量以及对制剂处方的设计、工艺改革和临床给药方案的制定都具有指导意义[6]。目前药物代谢研究的方法主要有体内和体外两种方法[7]。药物代谢的体外试验方法有离体肝脏灌流法、肝组织切片法、肝微粒体温孵法、肝细胞体外培养法等。其中，离体肝脏灌流法使肝脏具有独立并接近于生理条件的循环体系，具有器官水平的优势，兼具离体试验与整体试验的优点，是经典的研究药物代谢的方法；肝组织切片法不破坏肝脏的细胞构成和组织结构，完整保留了所有肝药酶及各种细胞器的活性，因而更能反映药物在体内生理条件下的实际代谢情况。体外代谢法可以比较方便地控制某些代谢条4件，在短时间内可得到大量的代谢产物，易于尽快确定药物代谢途径及结构变化情况，但是其不能全面反映体内的综合代谢情况，与生物体内的真实代谢情况存在一定差异。而体内代谢法可以综合地考虑各种体内因素对药物的影响，能够真实全面地反映药物代谢的体内整体特征。体内代谢法是指在动物或人服药之后，测定药物及其代谢产物在血液、尿液和胆汁等生物样品中的浓度，计算有关代谢速度参数，分离鉴定可能的代谢产物，解析药物代谢途径。目前常用的体内代谢法有药物探针法和体内指标法。其中药物探针法是借助于探针药物测定其清除率，以反映同工酶的活性，研究与该同工酶有关的其他药物的代谢。而体内指标法利用某些内源性物质及其代谢物的水平变化，反映药物代谢酶或代谢途径的变化。体内代谢法与体外法相比难度比较大，许多药物在生物体内的分布都比较广，使药物及其代谢产物在体内的浓度都比较低，代谢产物的检测具有一定的难度[8]。但是，随着现代分析技术的不断提高，体内代谢法逐渐被广泛应用。（四）生物利用度及生物等效性研究方法生物利用度是指制剂中药物被吸收进入体循环的速度与程度，它已经成为血管外给药制剂开发研究时必须考虑的重要质量评价指标。生物利用度与溶出度和释放度相比，更能反映药物的体内过程。即使溶出度或释放度相同的药物，其吸收的速度也不一定相同，而生物利用度则考虑了药物透膜吸收过程及其影响因素。此外，生物利用度的研究方法主要有血药浓度法、尿药浓度法及药理效应法，其测定结果与药物效应的关系更加密切。对生物利用度的研究，主要有实验设计方法、实验方法、实验结果处理、影响制剂生物利用度的因素考察等。生物等效性是指一种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给予相同剂量，其吸收程度和速度无明显差异。药学等效性与生物等效性不同，药学等效性是指同一药物相同剂量制成同一制剂，但非活性成分不一定相同，在含量、纯度、含量均匀度、崩解时间、溶出速度方面符合同一规定标准的制剂。药学等效性没有反映药物制剂在体内的情况，这是二者的主要区别。生物等效性指标的提出和应用，为药物应用于临床的有效性和安全性提供了进一步的保证。目前，药物制剂生物等效性已经成为国内外药物仿制或移植品种的重要评价内容，也成为药物制剂开发研究中最有价值的评价指标而被广泛应用。（五）临床药物应用方法研究在药物临床应用中，通过对药物体内过程规律的研究，尤其是对影响药物体内过程的各种因素的研究，可以指导合理给药方案的拟定和对临床用药问题进行合理解释。如5通过食物对药物吸收的影响研究和人体生物节律性对药物体内过程的影响研究等，可以确定最佳给药时间；通过不同生理、病理条件下药物体内过程的差异研究，可以制定个体化给药方案；通过联合用药对药物体内过程的影响考察，可以为临床联合用药提供依据等。（一）定量构效关系及定量构动关系研究定量构效关系（Quantitativestructure-activityrelationship，QSAR）与定量构动关系（Quantitativestructure-pharmacokineticsrelationship，QSPR），是一种借助分子的理化性质参数或结构参数，通过数学模式来探讨化合物的分子结构及性质与其在人体内的体内过程及药动学参数之间的定量关系[9]。根据配体与受体间相互作用的原理，计算机辅助药物设计（computer-aideddrugdesign，CADD）运用计算机进行QSAR和QSPR的研究，可以快速地设计和筛选目标化合物，有效地节省因化学合成和体内外实验而耗费的大量时间及资金，提高新药开发效率，缩短开发进程。（二）分子生物学技术与细胞生物学技术分子生物学技术与细胞生物学技术的发展大大促进了生物药剂学的研究进展。建立细胞培养模型使药物吸收的研究取得重要进展，其最早被用于筛选抗微生物药物，随着高通量药物筛选的需要，细胞模型迅速发展成熟起来。在药物设计与开发过程中应用细胞模型可以测定候选药物的透膜性能，研究其转运途径和代谢，以预测其是否具有优良的体内药动学特性，是否具有进一步开发的潜力[10]。Caco-2细胞模型（thehumancolonadenocarcinomacelllines）是目前最好的体外吸收模型之一，它作为药物吸收研究的快速筛选工具，可在细胞水平上提供药物分子透过小肠黏膜的吸收、分布、代谢、转运以及毒性的综合信息，已成为研究药物吸收机制和药物相互作用等的重要工具。Caco-2细胞系来源于人的结肠腺癌细胞，其结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞，含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现逆向分化不同。Caco-2细胞在传统的细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透的聚酯膜上可达到融合并自发分化为肠上皮细胞，形成连续的单层。与其它复杂的吸收模型不同的是Caco-2细胞模型没有很多不确定的变化因素，且存在于二、生物药剂学研究的新技术与新方法6小肠上皮中的各种转运系统、代谢酶都存在于Caco-2细胞中。因此Caco-2细胞模型可作为研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型。其优点为：省时；可测定药物的细胞摄取及跨膜转运；Caco-2细胞内有药物代谢酶，可在有代谢状况下测定药物的跨膜转运；Caco-2细胞同源性好，生命力强；可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。但Caco-2细胞也有一定的缺点：缺乏小肠上皮的粘液层；缺少细胞异质性（单一细胞构