第一章遗传毒理学概述

p1第一章概述第一节遗传毒理学的基本概念遗传毒理学(genetictoxicology)是研究化学物质和辐射及其他环境因子的致突变效应，以及接触诱变剂后对人类健康的后果。变异与突变众所周知，自然界中的任何生物物种，其形态和生理特征虽有千差万别，但在其生物进化过程中，都能以相对稳定的生命形式和物种而存在，并继续不断繁衍后代。这种长期保持遗传性状相对稳定的能力源自遗传物质。生物体的遗传物质主要是染色体。染色体主要由DNA和组蛋白组成。DNA是遗传的物质基础。生物的一切遗传特性均由基因控制。基因是在染色体上占有一定位置的遗传单位，是DNA分子的一个片段，携带有遗传信息。保持遗传性状的相对稳定，依赖于DNA的特殊结构及精确的复制，以及高保真度的修复能力。但是，各生物物种的个体和各代间仍存在差异，称之为变异(variation)。突变(mutation)是指生物体的遗传物质发生了突然的、根本的、可遗传的变化，因为这种变化起源于基因和染色体，因此，是可遗传的变异。化学物质或其他环境因素引起遗传物质发生突变的能力称为诱变性(mutagenicity)。化学物质和其他环境因素引起生物体遗传物质的突变效应，称为致突变作用(mutagenesis)。当遗传物质发生突变后，其子代可形成不同于亲代遗传性状的生物体，称为突变体(mutant)。1．自发突变与诱发突变突变依其发生的方式可分为自发突变(spontaneouemutation)和诱发突变(inducedmutation)，自发突变是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。自发突变的发生过程长，且频率很低，物种的进化与自发突变密切相关。诱发突变是由已知的某种化学、物理和生物等因素所引起的突变，它的发生过程短，且频率高。这种突变在一定条件下，将对人类健康造成不可逆的危害。2．诱变剂凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子(envirnmentalagent)，称之为诱变剂(mutagen)，也有人译为致突变原、致突变物、诱变原等。由于这些物质对生物体的作用点是遗传物质，故也称为遗传毒物(genotoxicagent)，突变可以是一个或几个碱基对的变化(基因突变)，也可以是染色体结构(染色体畸变)或数目(非整倍体和多倍体)改变的大变化，因此对后者也称为断裂剂(clastogen)和非整倍体物(aneugen)。凡是化学物质和其他环境因子本身能引起突变者，称之为直接诱变剂(directmutagen)；而有些化学物质本身并不能引起突变，必须经体内代谢活化，其代谢产物才具有诱变性，这类物质称为间接诱变剂(indirectmutagen)，或称为前诱变剂(promutagen)。p23．遗传毒性(genotoxicity)和遗传毒理学已如上述，诱变剂又称为遗传毒物。从另一角度而言，遗传毒物的生物效应即为遗传毒性，这种毒性作用是由于化学物和其他环境因子与DNA相互作用，引起生物细胞基因组分子结构的特异改变，这种有害作用即为遗传毒性。也可以说，它是诱变性的深入描述，揭示了这种毒性作用的终点。遗传毒理学正是研究化学物质和其他环境因子对DNA损伤的遗传学改变，以及对细胞和机体损害的机制。所以，人类接触诱变剂，受人关注的理由：一是增加了人类生殖细胞的突变率，以引起后代遗传性疾病发生率的增加；二是体细胞突变可导致接触个体的各种异常，最显著的是肿瘤。因此，遗传毒理学发展迅速，备受毒理学家们关注。第二节遗传毒理学的研究内容、任务和方法[1,2,7]毒理学研究的对象是毒物。遗传毒理学作为毒理学的一个分支，其研究的对象则是遗传毒物，即研究人类生产和生活环境中遇到的各种化学、物理和生物等环境因子能导致生物体遗传物质的损伤或遗传学改变的任何物质或因子。一、研究内容遗传毒理学研究内容的特点主要有三方面，即致突变机制、诱变剂的检测和对健康的危险度评定。(一)研究致突变机制遗传毒性作用的发展过程，从机制上讲，首先也有与一般毒性作用发展相一致的过程，包括4个阶段，第一阶段是从诱变剂接触生物体并到达靶分子的过程，即吸收、分布、排泄或重吸收、活化和解毒等；第二阶段是具有活性的化学物与靶分子相互作用的过程；第三阶段是诱变剂诱发靶分子的功能异常；第四阶段是分子修复机制的异常，这是一个导致毒性作用发展的全过程。而致突变机制，在此基础上，还有诱变剂与DNA相互作用的机制，从而引起各种类型的基因突变，以及不以DNA为靶而形成遗传毒性的机制。此外，还应研究诱发突变后，导致疾病结局的机制，如突变到肿瘤的发生、发展机制。(二)检测诱变剂应用各种检测系统检测化学物或其他环境因子是否具有诱变性以及刻画其特征，如诱变剂系直接诱变剂或间接诱变剂，可诱发基因突变或染色体断裂/整倍体物质。诱发的基因突变是碱基对置换或移码突变、诱发染色体结构的改变抑或数目异常，这些都是诱变剂检测的内容。为此目的，遗传毒理学家们建立了许多体内、体外试验(称之为测试系p3统)，这些试验以不同的遗传学终点为观察终点，以不同的生物体或生物细胞为遗传指示物。当前，又建立了许多分子终点的新方法，以提供化学物诱发分子损伤的证据，为遗传毒理学开辟了新的前景。例如，单细胞凝胶电泳试验(Comet试验)、荧光原位杂交(Fish)技术、应用转基因动物等，不仅推动了检测诱变剂，并可检测慢性或低剂量接触条件下的DNA损伤。(三)评定诱变剂对健康的危险度危NNNg(riskaSsessment)是对人类检测诱变剂后，潜在遗传毒性作用的量化与特征化评价过程。为此，研究的内容包括：1．化学物质或其他环境因子的定性、定量鉴定正如所述，应用各种测试系统鉴定人类接触的化学物质和其他环境因子的诱变性，并观察剂量一效应(反应)关系，以此对照人类接触水平，评价对人的相对危险度。2．环境中诱变剂的监测为评定某一诱变剂对人健康的危险度，并予以量化，首先须了解该诱变剂在环境中韵存在量及其迁移规律，这样才能建立“接触一剂量一反应”间的量化关系，为此，目前开展了许多利用动、植物的现场监测诱变剂的方法、现场采集样品的方法，以及在进行致突变试验前对环境样品预处理方法等的研究。3．生物标志物的研究．从接触诱变剂到出现各种损害，其中经历一个发展过程。在这过程中机体出现一系列的变化，这些变化能尽早被识别，就是依靠识别的标志物(marker)，利用人体不同的生物材料，检查接触遗传毒物(或其代谢物)的数量、遗传毒物引起的生物效应、机体对遗传毒物反应的能力与水平。这些利用生物材料识别的标记，就是生物标志物(biomarker)，它可在危险度评定时，提供人体接触剂量、生物效应和个体易感性的资料。目前，已建立了许多分子和细胞生物标志物，如微核、SCE、DNA加合物、癌基因或抑癌基因的过量表达产物等。4．人群监测对那些已知或怀疑接触诱变剂的人群进行筛检，有助于接触量和危险度的评定；监测可采用人类生殖细胞和体细胞。应用生殖细胞的监测有益于评定子代遗传性疾病的危险度；应用体细胞的监测可评定接触个体的危险度，而且，检测体细胞致突变效应的方法更为先进。以往普遍应用人类血细胞(如淋巴细胞、红细胞)作为“岗哨细胞”，测定接触的生物标记，提供健康危险的早期警示信号。现在认为，应用其他易于获得的而更能代表疾病靶细胞的人类细胞，在危险度评定及疾病预防研究中更为可信。目前研究较多的细胞类型包括：口腔黏膜细胞、鼻腔黏膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞、支气管肺泡灌洗液中的细胞、脱落的结肠细胞、泌尿道上皮细胞、宫颈上皮细胞。通常选用的生物标记有：微核、p4DNA加合物、DNA链断裂、非整倍体、程序外DNA合成和基因突变(如K—RAS、P53)等。人群监测的另一项内容是代谢基因的多态性研究。现有资料表明，代谢酶基因多态性影响到诱变剂生物效应和健康或疾病结局，最重要的是细胞色素P一450、谷胱甘肽转移酶和N一乙酰化转移酶基因。有人发现P一4501A2的水平可差异40倍或以上，在一群低剂量吸烟者中，慢NAT2基因型者与快型相比，具有较高水平的加合物，是处于危险状态的基因型。GSTMl无效基因型者患膀胱肿瘤的危险度增加了80％。因此，在危险度评定时，对易感人群和一般人群的模式将是完全不同的。5．流行病学研究应用流行病学调查的方法，如前瞻性调查、回顾性调查、病例对照研究、列队研究等，调查某一效应物接触者或人群的健康状况或健康危害和结局，提供诱变剂对人群健康危害，特别是诱发人类生殖细胞或体细胞突变后，所造成后果的人群证据。遗传毒理学研究内容所获得的资料，为危险评定奠定了信息基础，将最新资料或信息，建立构一效关系和量一效关系的数据库，并建立多种变数在内的危险度评定的计算机模式，也将成为遗传毒物危险度评定的重要内容。二、研究任务遗传毒理学的主要任务是阐明化学物质或其他环境因子对人体细胞遗传物质的损伤及对人类的遗传学改变，探讨遗传毒物与基因的交互作用、诱发遗传毒性的机制，对人体健康的影响与危险度评定，探索遗传毒物对人体早期损害的指标，建立预警体系。并在此基础上，采取干预措施，确保人体健康。三、研究方法除一般毒理学的研究方法均被应用于遗传毒理学研究外，根据研究对象和内容，还包括其特有的三部分研究方法。(一)致突变性试验致突变。l生试Nt(mutagenicityassays)是一类用以检测遗传毒性物质的试验。任何一种因子在这些试验项目中或其他DNA损伤试验中能引起可重复的阳性反应者，均考虑为具有遗传毒性作用。这些阳性反应是基因突变、染色体断裂效应、重组效应、致非整倍体或多倍体等。目前，已有多达200种以上的试验用于检测诱变剂，这些试验分别应用微生物、培养的哺乳动物细胞、植物、昆虫和哺乳动物。但是，多数还是采用微生物和哺乳动物细胞培养。这些试验快速、经济，最多几天可获结果，故常称之为短期测试系统(short-termtestsystem)。而最昂贵而费时的哺乳动物试验多用于具有特殊意义的环境因子或基础研究和危险度评定。在众多的短期测试系统中，其被广泛应用的是Ames试验和细胞遗传学试验(详见第十七章)。但是，通过表型作为观察终点的试验，常常有一定百分比p5的假阳性或假阴性。并且，难以回收突变子进行深入的突变分析。为此，20世纪90年代以来，建立了一些分子终点的新方法。例如基于应用应激基因反应的试验，荧光原位杂交(Fish)应用于细胞遗传学终点的测定，在内源性和转基因报道基因中评价基因突变，应用单细胞凝胶电泳试验(Comet试验)可敏感地检测单个细胞中由于毒性引起的直接DNA损伤，以及由于与细胞死亡相关的DNA降解而引起的间接DNA损伤。(二)突变的分子分析现代致突变研究已将遗传学分析和分子分析结合起来，用突变的分子分析(rnolecularanalvsisofmutation)来研究突变的特征。其方法是：早期有突变体蛋白与野生型蛋白的比较，以阐明蛋白质编码基因的变化。现在对核酸的直接分析，以及DNA技术使致突变研究取得了革命性的进展。因为点突变和缺失，通常不能靠表型予以鉴别，但可以通过针对靶基因的探针和Southern印迹技术，基因突变的特征还可用DNA序列分析。由此，可获得基因突变的类型与突变位点(hotspots)，揭示化学物质诱发的突变谱，可在分子水平上揭示突变的特征。此外，还可应用转基因系统(transgenicsystem)。该系统通过将作为靶基iNN--N#bN性DNA序列转染到细胞或动物受精卵的雄性原核，建成转基因细胞系或转基因动物，以此与受试物接触，分析靶基因的突变率、突变谱，以揭示受试物诱发突变的特征。穿梭质粒也已用于研究哺乳动物细胞中的DNA损伤过程，因为穿梭质粒也携带有检测突变的靶基因。例如作者建立的pESnx．FL穿梭质粒系统，以邻苯二酚氧化酶基因为靶基因，构建于EB病毒类质粒pESnx上，转入人新生儿羊膜细胞(FL)而建成的。由于它可在哺乳动物细胞中复制，因此，化学物诱发pESnx—FL靶基因的突变，可通过回收细胞中的靶基因，再转入细菌而检测，并进行序列分析。而且，成功地建立了携带邻苯二酚氧化酶靶基因的质粒载体转基因小鼠，已用于遗传毒性