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130等离子纳米结构修饰的酶电极的光谱电化学介绍.............................................................................................1014纳米多层电极.............................................................................1016粗糙银电极........................................................................................1016Au-Ag和Ag-Pt电极.........................................................................1018光谱电化学......................................................................................1020Ag-TiO2电极......................................................................................1022计算拉曼增强因子......................................................................1023确定生物电催化中电子转移的途径................................................1025人亚硫酸盐氧化酶............................................................................1027膜结合的氢化酶（MBH）...............................................................1028转换率的测定...................................................................................1029结语............................................................................................1029参考文献....................................................................................10302摘要纳米贵金属表现出独特的光学性质。其中性质之一就是在光照射下，能够产生局部表面等离子体共振,这使得它可以通过表面增强光谱学来研究吸附的分子成为可能。通过电化学的粗加工或电沉积方法可以使金和银纳米结构的电极带有等离子体的属性。为了研究酶/电极系统的金属表面必须进行官能化使其具有生物相容的表面层。一旦电极并入到电化学电池系统就可以通过光谱电化学进行研究。这种组合方法催化效率可以通过电化学方法测得而酶的结构状态是通过表面增强拉曼光谱探测。本章将罗列一些由电化学方法来构造等离子电系统的技术。焦点是将混合形成的电极系统,让它可以研究酶/电极间的相互作用而非离子体接口。此外光谱电化学对几个酶/电极系统进行了讨论。它表明了电化学与光谱的结合方法可以用来深度观察酶表面的功能。这些信息可以被用于设计合理的生物传感器和生物燃料电池。关键词酶生物燃料电池纳米贵金属表面等离子体共振表面增强拉曼光光谱电化学结构与功能的关系介绍纳米贵金属表现出独特的光学性质。其中性质之一就是在光照射下，能够产生局部表面等离子体共振[1]。表面等离子体共振是指在金属表面存在的自由振动的电子与光子相互作用产生的沿着金属表面传播的电子疏密波。根据纳米结构的尺寸、几何形状和化学成分,在特定波长的入射光下可以使光子和电子气之间达到共振耦合。在共振条件下，表面等离子体会在金属/介质界面会产生一个强大的局部电场，这可用于表面束缚分子的光谱分析。最先进的光谱分析方法是利用表面增强拉曼光谱学(SER)，它有很强大的关于识别表面束缚样本的分子和结构的能力。相比于更容易应用和不需要高成本设备的电化学粗加工或电沉积技术，各类文献中所描述的构造具有光学性质的等离子体纳米结构大多数都是基于高成本的光刻方法[2-6]。虽然它们缺乏表征表面形貌，但电化学构造的纳米结构表现出的等离子增强已经满足表面增强拉曼光谱学。另外这些等离子体载体可以作为电化学电池的工作电极，在其上面进行的氧化还原反应过程中可以用光谱来分析被吸附的分子[5]。等离子体电极系统的兴趣点是生物3传感器和生物燃料电池领域的开发。在酶生物传感器中，酶/电极系统的电催化响应可用于底物识别[6],而生物燃料电池的酶/电极复合体用于燃料的产生或消耗[7]。这些系统的优化需要对表面结合的酶的结构与功能的关系有着详细的认知。这可以通过同时使用电化学和光谱的方法来获得。这样组合的好处在于,催化效率可以通过电化学测试得到,而酶的结构是通过表面增强拉曼光谱探测获得（SERS）。然而,电极材料的选择对于酶/电极系统的效率有着很大的影响。生物电催化中的标准材料包括贵金属如金，铂或金属氧化物如二氧化钛和纳米铟锡金属氧化物[8,9]。在可见区域的激发波长下，等离子体增强最大的是银,它用于SER光谱的标准载体材料。然而，银作为生物电催化负载材料只起到次要的作用。这使得从SER光谱电化学所取得的成果难以转化成现实中的系统。解决这个问题的几种方法将在以下部分中描述:“纳米多层电极”被设计成等离子体混合含银电极作为等离子体放大器而不是酶吸附的金属或金属氧化物界面。氧化还原蛋白细胞色素C（Cytc）和细胞色素b5（Cytb5）被用作模板酶。在“拉曼增强因子的计算”这一节，它说明了在电化学方法帮助下可以计算出这些体系的表面磁场增强因子。“生物电催化中的电子传递途径”描述了电化学和表面光谱如何相结合来分析，以两个含血红素的酶为例（人亚硫酸盐氧化酶(hSO)[10]和膜结合氢化酶三聚物）[11]。对上述光电系统中的酶/电极体系的调查汇总在表1。纳米多层电极4本节中，使用电化学粗糙化的银和含有多层电极的银将就关于两者在酶/电极体系的SERR光谱电化学中的差异进行讨论。调查的结果汇总在表2中。粗糙银电极纳米银和其他贵金属电极可以通过电化学表面粗化的过程来构造。氧化还原循环法(ORC)应用于金属电极抛光。根据金属的氧化还原电位,时变位势的顺序可应用于纳米表面的形成。粗糙银电极表现出的SERS活性可以很容易地由ORC技术测得。在图1b，从电化学粗糙银电极的扫描电镜照片可以看出这是一个随机的珊瑚状纳米结构。Tian等人详细描述了关于什么样的序列施加到银和其他金属上可以达到最佳的SERS活性[12]。与光刻方法制成的高度有序的纳米结构相比，没有明显的共振频率可以来确定电化学电极的粗糙度。特别是粗糙银电极可以在一个波长范围从400nm到近红外区来实现表面的增强[13]。虽然这非常广泛的增强范围不利于吸附物的信号强度,但有利于激发线的选择。为了利用所述共振拉曼（RR）的效果，应选择分子吸收最大值的分析物，所以要特别选择生色团和入射光的波长。这个特定分析物的分子吸收最大和一个特定的表面等离子体共振的纳米电极不一定会匹配。粗糙电极的增强的宽范围，使它更容易将表面增强和共振拉曼散射的作用结合起来,并以应用于表面增强共振拉曼光谱(SERRS)对于吸附物的分析。5图1(a)纳米多层电极的制备方案。大部分银电极先进行电化学粗糙(步骤1),然后涂层绝缘介质隔离钝化(步骤2)。第三步金属离子附着在涂层电极发生电化学还原从而形成一个覆盖物薄膜。银电极的SEM照片显示以下步骤:粗加工(b)，二氧化硅涂层(c)，覆盖物沉积铂(d)，覆盖沉积物金(e)。(f,g)Ag-SiO2-Pt多层电极的电场计算电极几何形状没有(f)和(g)的缺陷。缺陷的引入到Pt表面促进局部增强在Pt/水界面[20]Copyright2009AmericanChemicalSociety,Fengetal.[23]Copyright2010Wiley-VCHandLyetal.[26]Copyright2012AmericanChemicalSociety除了银，其他的贵金属如金和铜等也能够在红外和近红外区产生表面等离子体共振。然而，银仍然是唯一在波长范围从500到400nm范围内产生等离子体局域增强的的材料。许多常见的蛋白质辅酶因子如血红素或黄素在这个范围分子吸光度很大。用SERR分析生物系统,只有银可以作为负载材料。6电化学调查发现银是第二选择材料,银电极的窄电位范围限制了它们的适用性，如传感器的发展。此外对于蛋白质电化学研究发现，银的生物相容性低，不利于吸附蛋白质。在银表面上涂薄层自组装单层膜[14]，SiO2[15]或高分子聚合物[16]可改善其生物相容性。任何涂层,增加了分析物与等离子体银表面的距离,从而减少分析物信号强度。介电涂层的厚度为大致2nm，这种效果是导致SER强度下降了一个数量级[17,18]。如果看电介质的表面电场的衰变，这种距离效应可以合理化。局部表面等离子体可以视为偶极振荡。电场，通过这种振荡产生，将衰减与D−3，D是偶极和分析物之间的距离。通过这种振荡产生电场，将在d−3处衰变，d是偶极子和分析物之间的距离。电场的强度是电场的绝对值的平方。另一个也必须考虑到,从分析物发射的拉曼散射光将会增强。因此,SER增强将引起第四电场大规模增强。这也导致SER增强正比于距离的近似值d−12。这个近似值是在几个假设下成立的：首先，拉曼增强散射光和入射光的是一样的，这种入射光可能并不适用于具有非常明确的表面等离子体共振条件的等离子体材料。第二，周围环境必须由一个电介质组成，并且电介质具有均匀的介电常数。这些假设可以适用于涂单层介质的粗糙电极。因此d−12距离与SER增强的关系可以得出在电极上涂上一层层分析物的不同厚度[17,19]。作为一个经验法则,这限制了SERR光谱研究比为4nm更近的等离子体表面分析物。Au-Ag和Ag-Pt电极如果单一介质涂层取代多层各自具有不同介电性能的结构，可以观察到SER增强依赖距离的强偏差性。一个例子是一个交替的绝缘涂层结构的电介质隔片和金属薄膜。在这种多层结构理论计算的预测是外界面上的增强电场在距离上远远大于体系中用单一均匀层的厚度[20,21]。分析物在多层电极只有底层等离子材料组成时(如银)，实验出乎意料的发现SER信号非常高。这样一来高SERS活性多层电极可以非常简单的通过电化学沉积来进行构造，如图1。构造这些多层结构,首先一个电化学粗糙化的银电极涂上一种由SAM[23]或者二氧化硅薄膜组成的电介质隔片[20,22]。功能化的SAM可以可通过链烷硫醇的溶液与一种适当的功能基团来在该电极上培养得到。隔片的厚度可通过选择SAM与不同长度的烷烃链进行调节。然而，利用这种方法只有涂层厚度达2.5纳米才可以获得。更广泛隔片厚度的的选择可以使用硅涂料，这种方法现在很完善[24]。二氧化硅薄膜是通过水解前驱体硅酸盐。二氧化硅涂层的厚度由前驱体的浓度控制[25]。生成的二氧化硅涂层覆盖在银电极完全不改变其表面的纳米结7构,如图1c。引入的隔片需要钝化的银表面和把银从第二金属膜分离。该第二金属膜是通过涂层的银电极在含有各金属离子的盐溶液中培养出来的。静电吸引力也导致在电介质隔片顶上方吸附金属离子。因此隔片的功能化与金属离子的电荷有关。AuCl4−或PtCl4−等带负电荷的离子,涂有末端氨基的SAM银电极将是非常好的。在二氧化硅涂层的情况下，最后的功能化是用氨基丙基硅烷（APTES）来构造。电极在金属离子溶液被培养数小时后，它被放回到电化学细胞缓冲溶液。在施加