第一部分核酸的制备(分离纯化)

第一部分核酸的制备（分离、纯化）核酸的制备（分离、纯化）一、总论二、以质粒DNA为例谈DNA的分离纯化三、以真核生物为代表介绍总RNA的纯化四、核酸的进一步纯化（聚乙二醇、氯化铯梯度离心问题：分离核酸的基本依据、方法？核酸分离主要需要注意的是什么？DNA和RNA分离时的主要差别？不同的生物体中，核酸所处的环境不尽相同：1、核酸与蛋白质结合紧密程度不同。2、DNA与RNA含量有差别。3、核酸分子量大小有差别。4、…..由于核酸性质基本相同，生物体所组成的成分基本相同，因此，对于不同的生物体核酸的分离方法相差不大。以上是常见核苷酸结构，中性PH下的离子状态的钠盐形式。结构决定性质，性质是分离的基础。核酸的结构特点：分子巨大，有共扼双键、氢键、苷键、和磷酸二酯键，自由氨基、磷酸基。核酸的二级结构：DNA双螺旋结构；RNA大多为单链，链的许多区域或自身发生回折，回折区内的多核苷酸段呈螺旋结构。核酸性质—核酸性质与其结构和组分是密切相关的分子量大小：RNA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106或者更大。DNA分子量1.6×106-2.2×109。性状和溶解度：DNA多为白色纤维状固体。RNA为白色粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有机溶剂（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。吸收光谱：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独特的紫外吸收光谱。核酸在240-260nm的紫外波段有强烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通过OD260/OD280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的OD260/OD280=1.8，纯RNA的OD260/OD280=2.0。核酸中若含杂蛋白或苯酚则比值明显降低。对于纯核酸样品只要读出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260=50ug/ml（双螺旋DNA）、1OD260=40ug/ml（单螺旋DNA或RNA）、1OD260=20ug/ml（寡核苷酸）。变性：加热、强酸碱或射线及一切可破坏核酸分子氢键的处理。变性后的核酸理化性质、生物功能都会有显著变化，最重要表现为粘度下降。降解：酸、碱、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。分离核酸共同要考虑的防止核酸变性与降解：①低温操作。②分离过程需加入必要的核酸解聚酶的抑制剂（如：乙二胺四乙酸（EDTA）、柠檬酸盐、皂土、8-羟基喹啉、SDS、苯酚等）脱蛋白：在生物体内核酸常与蛋白质结合以核蛋白形式存在，核酸所处的任何生物环境都含有蛋白质，所以在核酸纯化过程中需使用脱蛋白剂。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白质降解或变性，达到与核酸分离的目的。DNA和RNA的分离：1、利用DNA和RNA在不同盐浓度下，溶解度不同进行分离（DNA在1-2M时溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低盐浓度0.14M时溶解度大，DNA小。）2、通过使用DNA或RNA酶，达到DNA和RNA分离的目的。3、根据分子量不同，进行梯度离心，进行分离。核酸的收集：多用乙醇、异丙醇质粒DNA纯化细菌培养从LB琼脂扳上挑取一个单菌落。接种到含有适当抗生素的20ml液体LB中。37℃摇床培养过夜（OD＝0.6）。将上述培养液转入500ml含抗生素的液体LB培养基中。37℃300rpm约3～4hr（OD=0.4）。加入2.5ml氯霉素（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170ug/ml。300rpm37℃继续培养12～16hr。离心4℃4000rpm15min。弃上清。将细菌沉淀重悬于100ml预冷的STE中。离心4℃4000rpm15min。弃上清，收集细菌细胞。LB培养基Trypone10gYeastextract5gNaCl10g加水至1LSTE：0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.CL（PH8）1mmol/LEDTA（PH8）1、酚提取法：将收获的细胞重悬在20ml含20％蔗糖的TES中。加入新鲜配制的溶菌酶到终浓度为1mg/ml（枯草杆菌和大肠杆菌）或5mg/ml（苏芸金杆菌）。37℃保温30—90分钟，原生质游离出来。向原生质溶液中加8％SDS20ml和5MNaCl10ml。68℃保温5min。将溶液储于4℃冰箱，8hr以上或过夜。取出后，立即在4℃离心18000rpm,30min。取上清。向上清中加入等体积的重蒸酚（PH6—7），轻摇。置冰箱15min，离心取水相。重复一次。再用等体积的氯仿—异戊醇（24：1）抽提1—2次。离心取水相。加入等体积的乙醚抽提1—2次。向水相加两倍体积95％冷乙醇。－20℃过夜或－70℃半小时。离心15000rpm,20min,沉淀DNA。75％的乙醇洗涤一次，室温或真空干燥。沉淀溶于PH8的TE缓冲液中。2、碱裂解法将细菌沉淀重悬于10mlSlution1中。加入1ml新配制的溶菌酶。加入20ml新配制Slution2，充分混匀。放置5—10min(0℃)。加入15ml预冷的Slution3混匀置冰上10min离心，4℃，10000rpm/min,15min取上清并加入0.6倍体积的异丙醇充分混匀室温放置10分钟离心，室温5000rpm,15min弃上清，用70％乙醇洗涤弃乙醇，干燥。用3mlTE(PH8)溶解核酸沉淀可用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心或聚乙二醇沉淀继续纯化SlutionI50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(PH8)10mmol/LEDTA(PH8)Slution20.2mol/LNaOH(用时用10mol/L储存液稀释)1％SDSSlution35mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml3、煮沸裂解法：将细菌沉淀物重悬于预冷的10mlSTET中加入1ml(10mg/ml,溶于10mmol/LTris,PH8)新配制的溶菌酶室温下放置10分钟明火加热至沸腾，并不停摇晃立即将其浸入沸水中40秒再将其浸入冰水中5分钟离心，4℃15000rpm,30min取上清，用乙醇或异丙醇沉淀可继续用氯化铯－溴化乙锭梯度离心纯化STET0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(PH8)1mmol/LEDTA(PH8)5％TritonX—1004、SDS裂解法：将细菌沉淀物重悬于10ml，预冷的10％蔗糖，50mmol/LTris.Cl(PH8)溶液中加入新配制的溶菌酶溶液加入8ml0.25mol/LEDTA(PH8)溶液，摇匀。置冰上10分钟加4ml10%SDS,马上用玻璃棒迅速混匀内容物。立即加入6ml5mol/LNaCl(使终浓度为1M〕混匀。置冰上1hr离心15000rpm,30min取上清酚：氯仿和氯仿各抽提一次取水相，并加两倍体积乙醇，混匀。放置室温下1－2小时离心，4℃5000rpm20min。弃上清，用70％乙醇洗涤离心，4℃5000rpm20min，取沉淀。用3mlTE(PH8)溶解DNA可用氯化铯－溴化乙锭梯度离心继续纯化DNA继续纯化聚乙二醇沉淀法纯化DNA：取3ml溶于TE中的核酸溶液，加入3ml预冷5mol/LLiCl溶液，充分混匀。离心，4℃10000rpm10min取上清并加入等体积的异丙醇，混匀。离心，室温，10000rpm10min弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀保留沉淀并用500ul含胰RNA酶（20ug/ml）的TE（PH8〕溶解沉淀。室温放置半小时加入500ul含13％（W/V）聚乙二醇的1.6mol/LNaCl，充分混匀。离心，4℃12000rpm5min去上清，保留沉加入400ulTE(PH8)溶解沉淀用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次取水相并加入100ul10ml/L乙酸铵混匀，并加入两倍体积乙醇室温放置10min离心，4℃12000rpm5min回收沉淀加入200ul4℃的70％乙醇，混匀。弃上清，等乙醇蒸发殆尽500ulTE（PH8〕溶解沉淀储存DNA于－20℃或－70℃DNA继续纯化1、氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA（连续梯度离心法〕精确测量DNA溶液的体积按1g/ml的用量加入固体CsCl加热至30℃并温和混匀。每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水〕立即将其于DNA－氯化铯溶液混匀离心，室温8000rpm5min将下层清亮红色溶液转移到适当的离心管中用轻石蜡油加满，并封口。离心，20℃45000rpm16hr结果DNA继续纯化收集闭环DNA从DNA中除去溴化乙锭2、不连续梯度离心：此方法是将不同浓度的CsCl溶液分层加到离心管中，这样可加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到6hr。从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭方法1：有机溶剂抽提将DNA溶液放入试管中加等体积的饱和1－丁醇或异戊醇振荡混匀两相离心，室温1500rpm3min取水相反复抽提4－6次直到粉红色从水相中和有机相中消失。从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭方法2：离子交换层析如图所示，用吸管装一支DowexAG50树脂的柱子（装柱前需将树脂进行平衡）。平衡方法如下：1、适量DowexAG50树脂溶于100ml1mol/LNaOH中，搅拌5分钟，待树脂沉淀后，吸出上清弃去。2、加100ml1mol/LHCl，继续搅拌5分钟，树脂沉淀后，吸出上清弃去。3、用水重复步骤两次（每次100ml），然后用TEN缓冲液（100ml）重复步骤2一次。TEN缓冲液：（0.1mol/LTris.Cl(pH8.0)，0.01mol/LEDTA(pH8.0)，1mol/LNaCl）4、于4℃将树脂储存于含0.2%叠氮钠的TEN缓冲液中。吸去树脂上的缓冲液，用2倍体积的TE（Ph8.0）洗柱，将含有溴化乙锭和氯化铯的DNA直接加到树脂上。收集流出物，当所有DNA溶液进入柱子后，用1.2倍柱体积洗脱，同时继续收集流出物。•柱子流干后，将收集的流出物用2倍体积的水稀释。用6倍体积的乙醇，于4℃下，沉淀DNA15分钟。•4℃，1200转/分离心15分钟，收集DNA沉淀。•用4℃的70%乙醇洗沉淀，按上步重新离心，取沉淀。•用适量TE（pH8.0）溶解DNA。RNA纯化中很重要的一个任务是：严格控制RNA酶的活性！！因为，所有的组织、人的手指、试剂、容器等中均存在或被污染RNA酶，所以，在对RNA纯化前，需做大量的准备工作。常使用的RNA酶的抑制剂：（1）焦碳酸二乙酯（DEPC）：它是RNA酶的化学修饰试剂。它和RNA酶的活性基团—组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活。（2）异硫氰酸胍（GITC）：目前认为是制备RNA最有效的抑制剂。它除了对RNA酶有强烈的变性作用外，还具有使细胞结构破坏，核酸从核蛋白中解离的作用。（3）钒氧核苷酸复合物：是氧化钒离子和任何核苷形成的复合物。可与RNA酶结合，而抑制酶活。（4）RNA酶抑制蛋白：是一种对RNA酶有抑制作用的蛋白质。其它如肝素、DTT、SDS等都是RNA酶的抑制剂，在RNA提纯中经常使用动物组织总RNA的制备一、试剂：变性液（储存于棕色瓶中）：配制体积：52.8ml终浓度储存液异硫氰酸胍4M—25g柠檬酸钠25mM0.75M(pH7.0)1.76ml十二烷基氨酸钠0.5%10%(warmto65℃)2.64mlDEPC-ddH2O——29.3ml以上混合液可放置室温下3个月。用前加入0.36mlβ巯基乙醇。加入β巯基乙醇后，室温下可使用1个月。其于常规试剂配制不列举。方法：杀死小鼠，放血。迅速取出所需组织（按所需而定）用DEPC-ddH2O清洗一下，立即仍到液氮中。取4-5ml变性液入一洗净的研钵中备用从液氮中取出冻好的组织放入一不锈钢研钵中，倒入一些液氮，将其碾碎。（在此过程中，需保