第七章PCR技术

第七章PCR技术Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应PCR的最早设想：1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。PCR的实现：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。1985年公开报道1987年PCR得到美国的专利权1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖第一节PCR技术的基本原理一、PCR技术的基本原理依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNApol的作用下合成新生的DNA互补链。二、PCR扩增过程1、高温变性在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA变性温度：94-97℃，常95℃30-50s，常30s2、低温退火当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。退火温度：25-60℃，常55℃60-90s，常60s3、适温延伸在DNApol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸反应延伸温度：70-74℃，常72℃60-120sPCR的反应动力学理论上为2n。30次循环，DNA产量达109拷贝实际上为(1+R)n。R为扩增效率，平均为75%30次循环，DNA产量实际为106-107拷贝三、PCR技术的特点高度的敏感性高度的特异性操作简便、快速适用样品的广泛性第二节PCR反应体系中的各组分分析一、引物引物的设计决定PCR反应的成败PCR的效率和特异性取决于：1、引物与模板的特异结合2、聚合酶对引物的有效延伸引物设计原则1、引物长度以16-30为宜引物过短，特异性降低引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过TaqDNApol的最适温度若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3‘端，不应有连续3个G或C5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体7、引物3‘端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，3‘端的末位碱基最好选TCG，而不选A。8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源9、引物5‘端可以修饰加酶切位点；用生物素、荧光物质、地高辛等标记；引入突变位点；引入启动子序列；引入蛋白质结合序列5‘端修饰后不影响正常的PCR反应引物的保存和使用浓度冻干，-20℃，可保存1年，常保存6月使用最终浓度：0.2-1.0μmol/L，适宜小于0.2μmol/L，影响产量大于1.0μmol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体二、DNAPolMullis最初使用的DNA聚合酶是E.coliDNApolI的Klenow片段缺点：1、Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。2、引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。1988年初，Keohanog改用T4DNApol进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。T7DNApol1976年，Chein分离出一种热稳定的聚合酶1986年，Erlich从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离并纯化了TaqDNApol，生长在70-75℃极富含矿物质的环境中1988年，R.K.Saiki等成功将TaqDNApol应用于PCR。水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的TaqDNApol。嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）提取的TthDNApol，活性是TaqDNApol的100倍栖热球菌（Thermococcuslitoralis）中分离的VENT酶，100℃时半衰期达95min酸热浴硫化裂片菌中分离的Sac酶，耐受100℃TaqDNApol的特点耐高温。在70℃下反应2h后其残留活性是原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)TaqDNApol酶活性75-80℃，150bp/s72℃，100bp/s70℃，60bp/s55℃，22bp/s37℃，1.5bp/S22℃，0.25bp/sTaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感Mg2+浓度过低，Taq酶活力下降；Mg2+浓度过高，使酶催化非特异性扩增TaqDNApol的忠实性TaqDNApol具有5‘→3’聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性，而无3‘→5’外切活性，因而无效正阅读功能，在扩增中可引起错配。TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4.降低Mg2+浓度（1.5mmol/L），降低dNTPs浓度（20μmol/L），提高退火温度（大于55℃），缩短延伸时间（60s）可提高TaqDNApol的忠实性，此时的平均错配率为5×10-6.低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对TaqDNApol的催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷基肌氨酸钠(小于0.02%)，SDS(小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性.非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40和Tritox-100)如5%时方能抑制该酶的活性.100℃加热10min以上加入10mmol/LEDTA，使其结合Mg2+三、DNA模板模板的来源培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本、血液、毛发、尿液、犯罪现场DNA或RNA，RNA作模板时要反转录成cDNA线性DNA分子，若为环状DNA，则用酶将其切成线形分子理论上102-104拷贝的模板可满足各种要求的PCR反应E.coliDNA—0.1ng—3×104拷贝人染色体DNA—0.1μg—3×104拷贝酵母DNA—1ng—3×104拷贝DNA样品尽量要纯，尤其不能有核酸酶及蛋白酶等大多PCR，对DNA模板的要求不严格，存在一定量的蛋白质、SDS等对实验影响不大没有交叉污染四、dNTPsdATP、dTTP、dGTP、dCTP.dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性dNTP溶液呈酸性，使用时应用1MNaOH将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解PCR常用的dNTP浓度为50～200umol/L4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。dNTP浓度过低会使反应速度下降，降低PCR产物的产量，但可提高实验的精确性。dNTP浓度过高，可加快反应速度，但也增加碱基的错配率和实验成本dNTP与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。五、PCR反应的缓冲液PCR中常使用10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8）缓冲液作用：调节pH值，使TaqDNApol作用环境维持偏碱性10-50mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，有利于引物退火，大于此浓度会抑制TaqDNApol的活性100μg/LBSA（小牛血清），保护酶0.05-0.1%Tween-20，保护酶5mmol/LDTT（二硫苏糖醇），保护酶10%DMSO（二甲基亚砜），减少模板二级结构，提高反应特异性5%甲酰胺或5%氯化四甲基胺（TMAC），提高反应特异性，对酶活性无明显影响六、Mg2+浓度PCR反应体系中，dNTPs、引物、DNA模板等中的磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+浓度Mg2+浓度要比dNTP的浓度高0.2-2.5mmol/L在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。七、PCR反应条件的选择变性温度与时间DNA中GC含量越高，要求的变性温度越高通常为95℃30s，或93℃-94℃lmin第一次反应时反应管达到所需温度需要一段时间，因此要适当延长时间。最好为95℃，7-10min，在以后的循环中，变性步骤设为95℃30s为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管中加入液体石蜡退火温度与时间退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个bp，G+C含量约50%的引物，55℃为最适退火温度较为理想。公式帮助选择合适的温度：Tm=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm－(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些延伸终止最后一个反应循环结束后，应使PCR反应在72℃进一步延伸5min，以提高产物的扩增率，然后将反应混合液冷却至4℃，或加入EDTA到10mmol/L终止反应循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。八、标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L2个引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul九、PCR扩增产物的分析凝胶电泳分析酶切分析分子杂交核酸序列分析第三节PCR技术的分类正常PCR（NormalPCR）一般的DNA模板采用一对引物，经30轮左右循环扩增，即可达到预期的目的常用于多拷贝DNA分子的扩增PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳巢式PCR（NestedPCR）先用一对引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后再用另一对引物扩增第一次PCR产物半巢式PCR：只有一个外引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后用另一对内引物扩增PCR产物中途进退式PCRDrop-inDrop-outPCR外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度，而第二次PCR采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高的退火温度内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后,无须取出第一次PCR产物，只需降低退火温度，即可直接进行第二次PCR扩增.复合PCRMultiplexPCR，多重引物PCR，多重PCR在同一PCR反应中，用多组引物同时扩增几个基因片段的技术不对称PCRasy