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84第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecularluminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。荧光分析法历史悠久。早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，就发现含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes位移定律和荧光猝灭现象。到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。第二节分子荧光分析法的基本原理一、荧光（燐光）光谱的产生物质受光照射时，光子的能量在一定条件下被物质的基态分子所吸收，分子中的价电子发生能级跃迁而处于电子激发态，在光致激发和去激发光过程中，分子中的价电子可以处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述。一个所有电子自旋都配对的分子的电子态，称为单重态，用“S”表示；分子中的电子对的电子自旋平行的电子态，称为三重态，85用“T”表示。电子自旋状态的多重态用2S+1表示，S是分子中电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对时，即S=0，多重态2S+1=1，该分子体系便处于单重态。大多数有机物分子的基态是处于单重态的，该状态用“S0”表示。倘若分子吸收能量后，电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋平行（不配对）的电子，即S=1，多重态2S+1=3，该分子体系便处于激态三重态。符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程丧失多余的能量而返回基态。辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，伴随着荧光或燐光现象；无辐射跃迁的去活化过程是以热的形式辐射其多余的能量，包括内转化（ic），系间窜跃（isc）、振动弛豫（VR）及外部转移（ec）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。假设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二激发单重态S2及第一激发单重态S1，图9-1示意了分子内所发生的各种光物理过程。振动弛豫它是指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式放出。发生振动弛豫的时间为10－12S数量级。图9-1中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况。内转移当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低能级。图9—1所示，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。荧光发射处于第一激发单重态最低振动能级的电子跃回至基态各振动能级时，所产生的光辐射称为荧光发射，将得到最大波长为λ3的荧光。注意基态中也有振动弛豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3的荧光。荧光的产生在10－6～10－9S内完成。系间窜跃指不同多重态间的无辐射跃迁。如：S1→T1。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移到T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光，即产生延迟荧光。燐光发射电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动弛豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射燐光。这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10－4～10s。因此，这种跃迁所发射的86光，在光照停止后，仍可持续一段时间。外部转移指激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或燐光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：激发光谱和发射光谱。荧光激发光谱（或称激发光谱），就是通过测量荧光体的发光强度随激发光波长的变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。激发光谱的具体测绘办法，是通过扫描激发单色器以使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，由检测器检测相应的荧光强度，最后通过记录仪记录荧光强对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。从理论上说，同一物质的最大激发波长应与最大吸收波长一致，这是因为物质吸收具有特定能量的光而激发，吸收强度高的波长正是激发作用强的波长。因此，荧光的强弱与吸收光的强弱相对应，激发光谱与吸收光谱的形状应相同，但由于荧光测量仪器的特性，例如光源的能量分布、单色器的透射和检测器的响应等特性都随波长而改变，使实际测量的荧光激发光谱与吸收光谱不完全一致。只有对上述仪器因素进行校正之后而获得的激发光谱，即通常所说的“校正的激发光谱”（或“真实的激发光谱”）才与吸收光谱非常近似。如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光发射光谱（简称荧光光谱）。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为在荧光测定时选择适当的测定波长或滤光片的根据。和激发光谱的情况类似，在一般的荧光测定仪器上所测绘的荧光光谱，属“表现”的荧光光谱，只有对光源、单色器和检测器等元件的光谱特性加以校正以后，才能获得“校正”（或“真实”）的荧光光谱。溶液荧光光谱通常具有如下特征：1、斯托克斯位移斯托克期在1852年首次观察到荧光波长总是大于激发光波长，这种波长移动的现象称为斯托克斯位移。2、荧光发射光谱的形状与激发光波长无关分子的电子吸收光谱可能含有几个吸收带，而其荧光光谱却只含一个发射带。激发光波长改变，可能将分子激发到高于S1的电子能级，但很快经过内转移和振动弛豫跃迁到S1态的最低振动能级，然后产生荧光。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与87荧光体被激发到哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形状通常与激发光波长无关。3、荧光光谱与吸收光谱的镜像关系基态分子通常处于最低振动能，受激时可以跃迁到不同的电子激发态，会产生多个吸收带，其中第一吸收带的形成是由于基态分子被激发到第一电子激发单重态的各不同振动能级所引起的，因而第一吸收带的形状与的形状与第一电子激发单重态中振动能级的分布情况有关；荧光光谱的形成是激发分子从第一电子激发单重态的最低振动能级辐射跃迁至基态的各个不同振动能级所引起的，所以荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布情况（即能量间隔情况）有关。一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的，且荧光带的强弱与吸收带强弱相对应，因此，荧光光谱和吸收光谱的形状相似。另外，在第一吸收带中，S1态的振动能级越高，与S0态间的能量差越大，吸收峰的波长越短；相反，荧光光谱中S0态的振动能级越高，与S1态间的能量差越小，发射荧光的波长越长。所以，荧光光谱和吸收光谱的形状虽相似，却呈镜像对称关系。图9—2是蒽分子的吸收光谱和荧光光谱。不同的荧光物质结构不同，S0与S1态间的能量差不一样，基态中各振动能级的分布情况也不一样，所以有着不同形状的荧光光谱，据此可以进行定性分析。三、荧光的影响因素1、荧光的影响因素荧光量子产率（），定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值，即吸收的光子数发射的光子数激发分子总数发射荧光的分子数或荧光量子产率有时也叫荧光效率，反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质的荧光越强。前面已经提到，在产生荧光过程中，涉及到辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。若用数学式来表达这些关系，得到iffKkk式中fk为荧光发射过程的速度常数，iK为其它有关过程的速率常数的总和。显然，凡是能使fk值升高而使其它k值降低的因素，都可增强荧光。假如非辐射跃迁的速度远小于辐射跃迁的速度，即iK《fk，荧光量子产率的数值便接近于1。在通常情况下，的数值总是小于1。不发荧光的物质，其荧光量子产率的数值为零或非常接近于零。一般说来，fk主88要取决于化学结构，而iK则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。2、荧光与化合物结构的关系了解荧光与分子结构的关系，可以预示分子能否发光，在什么条件下发光，以及发射的荧光将具有什么特征，以便更好地运用荧光分析技术，把非荧光体变为荧光体，把弱荧光体变为强荧光体。但由于至今对激发态分子的性质了解不深，还无法对荧光与分子结构之间的关系进行定量描述。（1）有机物的荧光①共轭效应具有共轭双键体系的芳环或杂环化合物，其电子共轭程度越大，越容易产生荧光；环越多，发光峰红移程度越大，发光也往往越强。如表9—1所示，苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区，丁省位绿区，戊省位于红区，且均比苯的量子产率高。表9-1几种多环芳烃的荧光化合物F)(/nmeme苯0.11205/278萘0.29286/321蒽0.46365/400丁省0.60390/480戊省0.52580/640同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性者要长。例如：蒽和菲的荧光波长分别为400nm和350nm；丁省和苯[α]蒽的荧光峰分别为480nm和380nm。②刚性结构和共平面效应一般说来，荧光物质的刚性和共平面性增强，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，即使外转移能量损失减小，从而有利于荧光的发射。例如：芴与联二苯的荧光效率分别约为1.0和0.2。这主要是由于亚甲基使芴的刚性和共平面性增大的缘故。芴联二苯CH289如果分子内取代基之间形成氢键，加强了分子的刚性结构，其荧光强度将增强。例如：水杨酸的水溶液，由于分子内氢键的生成，其荧光强度比对（或间）羟基苯甲酸大。COOHOH某些荧光体的立体异构现象对它的荧光强度也有显著影响，例如：1.2一二苯乙烯CHHCCCHH其分子结构为反式者，分子空间处于同一平面，顺式者则不处于同一平面，因而反式者呈强荧光，顺式者不发荧光。③取代基的类型和位置取代基对荧光体的影响分为加强荧光的、减弱荧光的和影响不明显的三种类型。加强荧光的取代基有—OH，—OR，—NH2，—CN，—NHR，—NR2，—O