电子显微镜

扫描电子显微镜（SEM）是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜的优点是，①有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；②有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；③试样制备简单。目前的扫描电镜都配有X射线能谱仪（EDS）装置，这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析，因此它是当今十分有用的科学研究仪器。一、基本原理扫描电子显微镜的制造依据是电子与物质的相互作用。扫描电镜从原理上讲就是利用聚焦得非常细的高能电子束在试样上扫描，激发出各种物理信息。通过对这些信息的接受、放大和显示成像，获得测试试样表面形貌的观察。当一束极细的高能入射电子轰击扫描样品表面时，被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征x射线和连续谱X射线、背散射电子、透射电子，以及在可见、紫外、红外光区域产生的电磁辐射。同时可产生电子-空穴对、晶格振动（声子)、电子振荡（等离子体）。扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品，仅在样品表面扫描激发出次级电子。放在样品旁的闪烁晶体接收这些次级电子，通过放大后调制显像管的电子束强度，从而改变显像管荧光屏上的亮度。显像管的偏转线圈与样品表面上的电子束保持同步扫描，这样显像管的荧光屏就显示出样品表面的形貌图像，这与工业电视机的工作原理相类似。扫描式电子显微镜的分辨率主要决定于样品表面上电子束的直径。放大倍数是显像管上扫描幅度与样品上扫描幅度之比，可从几十倍连续地变化到几十万倍。扫描式电子显微镜不需要很薄的样品；图像有很强的立体感；能利用电子束与物质相互作用而产生的次级电子、吸收电子和X射线等信息分析物质成分。背散射电子背散射电子是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子，其中包括弹性背反射电子和非弹性背反射电子。弹性背反射电子是指倍样品中原子和反弹回来的，散射角大于90度的那些入射电子，其能量基本上没有变化（能量为数千到数万电子伏）。非弹性背反射电子是入射电子和核外电子撞击后产生非弹性散射，不仅能量变化，而且方向也发生变化。非弹性背反射电子的能量范围很宽，从数十电子伏到数千电子伏。从数量上看，弹性背反射电子远比非弹性背反射电子所占的份额多。背反射电子的产生范围在100nm-1mm深度。背反射电子产额和二次电子产额与原子序束的关系背反射电子束成像分辨率一般为50-200nm（与电子束斑直径相当）。背反射电子的产额随原子序数的增加而增加（右图），所以，利用背反射电子作为成像信号不仅能分析新貌特征，也可以用来显示原子序数衬度，定性进行成分分析。二次电子二次电子是指背入射电子轰击出来的核外电子。由于原子核和外层价电子间的结合能很小，当原子的核外电子从入射电子获得了大于相应的结合能的能量后，可脱离原子成为自由电子。如果这种散射过程发生在比较接近样品表层处，那些能量大于材料逸出功的自由电子可从样品表面逸出，变成真空中的自由电子，即二次电子。二次电子来自表面5-10nm的区域，能量为0-50eV。它对试样表面状态非常敏感，能有效地显示试样表面的微观形貌。由于它发自试样表层，入射电子还没有被多次反射，因此产生二次电子的面积与入射电子的照射面积没有多大区别，所以二次电子的分辨率较高，一般可达到5-10nm。扫描电镜的分辨率一般就是二次电子分辨率。二次电子产额随原子序数的变化不大，它主要取决与表面形貌。特征X射线特征X射线试原子的内层电子受到激发以后在能级跃迁过程中直接释放的具有特征能量和波长的一种电磁波辐射。X射线一般在试样的500nm-5mm深处发出。俄歇电子如果原子内层电子能级跃迁过程中释放出来的能量不是以X射线的形式释放而是用该能量将核外另一电子打出，脱离原子变为二次电子，这种二次电子叫做俄歇电子。因每一种原子都由自己特定的壳层能量，所以它们的俄歇电子能量也各有特征值，能量在50-1500eV范围内。俄歇电子是由试样表面极有限的几个原子层中发出的，这说明俄歇电子信号适用与表层化学成分分析。产生的次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。原则上讲，利用电子和物质的相互作用，可以获取被测样品本身的各种物理、化学性质的信息，如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等等。具体功能用途归纳如下：1、扫描电镜追求固体物质高分辨的形貌，形态图像(二次电子探测器SEI)-形貌分析(表面几何形态，形状，尺寸)2、显示化学成分的空间变化，基于化学成分的相鉴定---化学成分像分布，微区化学成分分析1)用x射线能谱仪或波谱(EDSorWDS)采集特征x射线信号，生成与样品形貌相对应的，元素面分布图或者进行定点化学成分定性定量分析，相鉴定。2)利用背散射电子BSE)基于平均原子序数(一般和相对密度相关)反差，生成化学成分相的分布图像；3)利用阴极荧光，基于某些痕量元素(如过渡金属元素，稀土元素等)受电子束激发的光强反差，生成的痕量元素分布图像。4)利用样品电流，基于平均原子序数反差，生成的化学成分相的分布图像，该图像与背散射电子图像亮暗相反。5)利用俄歇电子，对样品物质表面1nm表层进行化学元素分布的定性定理分析，扫描电子显微镜正是根据上述不同信息产生的机理，采用不同的信息检测器，使选择检测得以实现。如对二次电子、背散射电子的采集，可得到有关物质微观形貌的信息；对x射线的采集，可得到物质化学成分的信息。正因如此，根据不同需求，可制造出功能配置不同的扫描电子显微镜。利用电镜的透射或散射电子进行其它功能的分析，可以得到材料的其它一些信息。主要有：成分分析、晶体结构分析、粒度分析、阴极发光观察二、样品制备：SEM生物样品制备：扫描电镜观察时要求样品必需干燥，并且表面能够导电。因此，在进行扫描电镜微生物样品制备时一般都需采用清洗、固定、脱水、干燥及表面镀金等处理步骤。生物样品的制备中，干燥是最关键的步骤。干燥过程除引起样品收缩之外，水的表面张力会使样品表面形貌发生很大的变化，这对扫描电镜的表面形貌观察特别有害。目前常用的干燥方法主要有空气干燥法、临界点干燥法、冰冻干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。此法的最大优点是简单易行和节省时间，它的致命缺点是在干燥过程中，组织会因脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，此种方法一般只适用于外壳(表面)较为坚硬的样品。在采用空气干燥时，为了减少样品的收缩变形，除使用易挥发和表面张力小的脱水剂如乙醇、丙酮等外，还应使样品得到充分固定，特别是须经四氧化锇固定效果才较好。因为它会使组织变得较为坚硬，使收缩变形减少。临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤，此法所用的仪器结构不甚复杂，操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2h左右即可完成，所以，是最为常用的方法。所谓临界点，就是指使物质的气态和液态两相之间达到相同密度，成为均一流体状态时的温度和压力的总称。此时的温度称临界温度；此时的压力称临界压力。不同的物质都有其特定的临界点。冰冻干燥是将经冰冻的样品置于高真空中通过升华，除去样品中的水分或脱水剂的过程。冰冻干燥的基础是冰(或固态溶剂)从样品中升华，也就是使水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态,不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，因此，能较好地避免或减少了在干燥过程中对样品的损伤。冰冻干燥方法有两种，即含水样品直接冰冻干燥和样品脱水后从有机溶剂中冰冻干燥。茨烯干燥法，莰烯是一种樟脑类无色结晶体，能溶于醚、环乙烷、环己烯和氯仿中，室温下呈固体状，能在较低的温度下升华，从固态直接变成气态，表面张力小，故经它干燥的样品较松软，变形小，操作也较简便。d、样品的表面导电处理金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯、银及碳等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜(或碳膜)后，不仅能为入射电子提供通路，消除电荷积累的荷电现象，而且能提高二次电子发射率，增加倍噪比，提高图像反差，以便能获得细节丰富和分辩率高的图像。其次，样品经镀膜后，还能提高样品表面的机械强度，增强耐受电子束轰击能力，避免起泡、龟裂、穿孔、分解和漂移等不良现象的产生：此外，通过镀膜能把扫描电镜的信息来源限定于样品表面，即防止来自组织内部的信息参与成像。真空镀膜法是利用真空镀膜仪进行的。其原理是在高真空状态下(10-3Pa)，使某些金属物质加热到熔点以上时，蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，由于金属的沉积使样品表面形成一层薄金属膜。真空镀膜法所得的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，因此目前已经较少使用。真空蒸发仪主要用于制造碳膜、碳复型膜和金属投影。离子溅射镀膜法：在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。图10一4就是这种镀膜法的原理示意图。这种装置很简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成，在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压，两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着在样品表面而形成金属导电膜。组织导电法是利用某些金属盐溶液对生物体中的蛋白质、脂肪类及淀粉等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。这种方法近年来国内外均有不少报道。三、仪器结构扫描电子显微镜具有由三极电子枪发出的电子束经栅极静电聚焦后成为直径为50mm的电光源。在2-30KV的加速电压下，经过2-3个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成孔径角较小，束斑为5-10mm的电子束，并在试样表面聚焦。末级透镜上边装有扫描线圈，在它的作用下，电子束在试样表面扫描。高能电子束与样品物质相互作用产生二次电子，背反射电子，X射线等信号。这些信号分别被不同的接收器接收，经放大后用来调制荧光屏的亮度。由于经过扫描线圈上的电流与显象管相应偏转线圈上的电流同步，因此，试样表面任意点发射的信号与显象管荧光屏上相应的亮点一一对应。也就是说，电子束打到试样上一点时，在荧光屏上就有一亮点与之对应，其亮度与激发后的电子能量成正比。换言之，扫描电镜是采用逐点成像的图像分解法进行的。光点成像的顺序是从左上方开始到右下方，直到最後一行右下方的像元扫描完毕就算完成一帧图像。这种扫描方式叫做光栅扫描。扫描电子显微镜由电子光学系统，信号收集及显示系统，真空系统及电源系统组成。1.真空系统和电源系统真空系统主要包括真空泵和真空柱两部分。真空柱是一个密封的柱形容器。真空泵用来在真空柱内产生真空。有机械泵、油扩散泵以及涡轮分子泵三大类，机械泵加油扩散泵的组合可以满足配置钨枪的SEM的真空要求，但对于装置了场致发射枪或六硼化镧枪的SEM，则需要机械泵加涡轮分子泵的组合。成像系统和电子束系统均内置在真空柱中。真空柱底端即为右图所示的密封