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细胞生物学实验报告扫描电子显微镜生物样品制备与观察姓名：学号：班级：专业：同组成员：【实验目的】1、了解扫描电镜的基本结构与工作原理2、了解扫描电镜的基本使用方法3、了解临界点干燥仪的工作原理了解扫描电镜生物样品制备的基本过程【实验原理】扫描电镜主要用于观察样品表面几何形貌。一般扫描电镜生物样品制备过程包括取材、固定、脱水、干燥以及导电处理等步骤。取材时应尽量保护待观察的样品表面（如细胞表面、组织或器官的上皮表面等），并且避免样品表面在清洗过程中的人为损伤。一般生物样品需经干燥后才能在扫描电镜下观察。由于表面张力的作用，含水量大的生物样品在自然干燥过程中，其表面形貌将发生严重变形。为了观察生物样品真实的表面形貌，通常采用临界点干燥法对样品进行干燥处理。当气液两相处于临界点时，气体、液体密度相等，表面张力为零。因此，对生物样品进行临界点干燥，可以较好地保护其表面形貌。水的临界温度和压力分别为374.1℃和218.3大气压，显然，此条件下生物样品将受到严重损坏。由于CO2的临界温度和压力较低，为31.4℃和72.9大气压，故通常选择CO2作为生物样品临界点干燥的工作介质。固定、脱水后的样品需经过乙酸异戊酯处理，然后利用临界点干燥仪对样品进行干燥。由于生物样品导电性低，未经过导电处理的样品在扫描电镜下观察时会产生荷电现象，从而影响观察和照相记录。为了减少荷电效应，对生物样品表面要进行导电处理，通常使用离子溅射仪在样品表面喷镀金属导电薄层。喷镀的金属包括：金（Au），铂（Pt）及其合金等，喷镀导电薄层厚度在10nm左右为宜。对于花粉粒等含水量较少的生物样品，可以经过自然干燥后在扫描电镜下观察。入射电子术与固体样品原子之间的相互作用1、入射电子术与固体样品原子之间的相互作用。具有一定的能量的电子入射固体厚样品后收到样品原子的散射，产生二次电子、背散射电子以及特征x射线等。二次电子是从样品表面约10nm深度范围内被入射电子激发的低能电子，其能量约为0~50eV。一部分入射电子在样品内部经多次散射后从样品表面射出，这些电子被称为背散射电子。样品中不同元素的原子在受到入射电子电离激发时可以发射特征X射线。扫描电镜主要是利用二次电子像观察厚样品表面形貌。在观察样品微区表面形貌的同时，利用X射线显微分析技术可以对样品中的元素进行定性和定量分析。2、扫描电镜的基本组成和成像过程扫描电镜成像系统的基本组成由图1-1所示。电子枪、聚光镜和物镜等组成扫描电镜的电子光学系统。电子枪发射的电子经聚光镜和物镜的会聚作用形成极细的电子束入射样品。在扫描偏转线圈的控制下，入射电子束在样品表面做光栅状扫描。扫射过程中产生的二次电子由光电倍增管检测，该信号经视频放大器放大后输入观察显示器的栅极以调制其亮度。由于入射电子束与观察显示器的扫描偏转线圈均由同一扫描信号发生器控制，所以两者扫描同步。当入射电子束对样品某区域扫描时，在显示器上可以观察到该区域的二次电子像。像点的亮度与样品物点上所产生的二次电子信号强度相关。当来自物点的二次电子信号强时，对应的像亮点；反之则暗。3、扫描电子显微镜的技术指标分辨率、加速电压和放大倍数是扫描电镜的基本技术参数。扫描电镜的分辨率通常指二次电子像分辨率，该分辨率与入射电子束斑直径有关。配备热发射电子枪的扫描电镜分辨率约为3nm，而高分辨率场发射扫描电镜的分辨率在1nm左右。扫描电镜加速电压范围约为1-20kV。扫描电镜的放大倍数由观察显示器的尺寸与入射电子束在样品扫描区域尺寸之间的比值决定。通过改变入射电子束扫描区域的大小，可以提高或降低放大倍数，其范围为数十倍至数十万倍。4、二次电子像的衬度机制二次电子的产率η定义为二次电子数与入射电子数之间的比值，并且η∝1／cosθ，θ为入射电子束与样品表面法线之间的夹角。由于样品表面不是平整的，各点的θ值与η值不同，即样品表面各点的二次电子信号强度不同。因此二次电子像的衬度反应样品表面几何形貌。此外，由于入射电子束孔径角很小，二次电子像还具有景深大，立体感强的特点。【实验器材】（1）实验仪器扫描电镜、离子溅射仪（2）实验材料样品台、双面胶带、扫描电镜生物样品（百合花粉粒）【方法与步骤】（1）在样品上粘贴双面胶带，将自然干燥的百合花花粉粒分散、均匀的粘在胶带上，用离子溅射仪对样品表面喷镀导电薄层（厚度约10nm），准备在扫描电镜下观察。（2）开启扫描电镜真空系统电源，等待真空度达到工作状态（正常情况下约需30min）。（3）开启扫描电镜镜筒电源。（4）将样品置入电镜。（5）对于热发射钨灯丝扫描电镜，加高压至15~20kV。（6）加灯丝电流至饱和点。（7）在低放大倍数（数十倍）下，寻找样品感兴趣区。根据样品特性和感兴趣区大小，选取适当的工作距离与放大倍数，调节亮度与对比度，聚焦，校正像散，然后进行照相记录即可。（8）关机【实验结果】本次实验我们用扫描电镜对百合花粉粒进行观察并拍照记录，图一、图二是我们班级的一些实验照片。图一百合花粉粒扫描电子显微镜像图二百合花粉粒扫描电子显微镜像【讨论】思考题1、二次电子像的衬度与样品的何种特征有关？二次电子的产率η定义为二次电子数与入射电子数之间的比值，并且η∝1／cosθ，θ为入射电子束与样品表面法线之间的夹角。由于样品表面不是平整的，各点的θ值与η值不同，即样品表面各点的二次电子信号强度不同。因此二次电子像的衬度反应样品表面几何形貌。此外，由于入射电子束孔径角很小，二次电子像还具有景深大，立体感强的特点。2、为什么临界点干燥可以避免自然干燥对生物样品表面形貌的损伤？临界点干燥的原理是：在一定的温度和压力下，物质的液态和气态界面将会消失，液态瞬间转化为气态，形成非液非固的状态，即达到临界点（C.P）状态。在临界点时，表面张力消失，分子间的内聚力等于零，而在显微尺度上，表面张力对生物材料形态的影响十分强大。表面张力是存在于固-液、液-气界面上的主要物理力之一。液-气界面上表面张力的作用是造成生物样品收缩的主要原因。因此，利用临界点状态对材料进行干燥，材料理论上不会产生收缩和形变，对于质地较软的材料这种方法是最好的干燥方法。3、生物样品在扫描电镜观察前为什么要进行金属喷漆处理？由于生物样品导电性低，未经过导电处理的样品在扫描电镜下观察时会产生荷电现象，从而影响观察和照相记录。为了减少荷电效应，对生物样品表面要进行导电处理，通常使用离子溅射仪在样品表面喷镀金属导电薄层。喷镀的金属包括：金（Au），铂（Pt）及其合金等，喷镀导电薄层厚度在10nm左右为宜。【参考文献】[1]桑建利,谭信.细胞生物学实验指导.北京:科学出版社,2010.