第三十六章微生物检验的质量控制

第三十六章微生物检验的质量控制•质量控制（Qualitycontrol）是临床微生物实验室为保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系。•微生物检验不象其他检验专业的工作那样，随着科学技术的发展，越来越趋于自动化、精密化，质量控制工作也有规章可循。微生物检验专业发展的滞后，决定了微生物检验直到目前，定性试验、手工操作、主观判断仍是主要的工作方式，稍有不慎容易导致错误的结果，质量控制的目的就是要在操作过程中避免可变因素对结果的影响，保证结果的准确性、可靠性和重复性。微生物检验的质量控制包括室内质量控制和室间•质量评价。室内质量控制是由实验室内部制订并实施的，是保证每日工作质量的核心和基础。室间质量评价则是由实验室外部的组织或机构对实验室进行的质量评价。•第一节室内质量控制•室内质量控制—为保证临床微生物学检验结果的准确性而在实验室内采取的一系列行之有效的措施。•室内质量控制是微生物检验质量控制的核心，也是做好室间质评的基础和前提。主要包括以下几个方面的内容。•一、对微生物检验人员的要求、培训与组织管理•（一）要求•1.微生物实验室的负责人应由专业理论水平较高、操作熟练、经验丰富、有管理能力的微生物学专家担任。•2.微生物检验人员除应具有丰富的专业知识、熟练的操作技能、敏捷的思维判断能力外，还应具有严谨的科学态度、高度的工作责任感和无私的献身精神。•3.微生物检验人员应经常阅读有关技术资料，及时掌握新知识、新技术和本专业的发展现状及方向，不断进行专业技术的知识更新。•4.微生物检验人员应不断接受有关技术方面的继续教育和培训。•（二）培训•1.内部培训•1）定期讲课•2）考核鉴定能力•3）盲点检测•2.外部培训：走出去，请进来两种形式。•二、编写微生物检验操作手册和卡片•实验室内必须具有一本根据本实验室条件而编写的标准操作程序手册，间隔一段时间进行修订，删减过时需淘汰的内容，补充新的技术方法。并且赋予手册近似于法律的地位，使之成为全体工作人员操作时共同遵守的标准程序，不得随意更•改或简化。要求：内容全面，文字简练，方便使用，不断更新。•操作手册一般包括以下内容：实验室管理制度；本室开展的检验项目及最低鉴定要求；标本的采集和处理指南；微生物鉴定的简易程序；试剂、染色液和培养基的制备方法；药敏试验的方法和判读标准；实验室的安全与防护；各类参考数据；室内及室间质量控制；各类细菌生化反应简表。•三、培养基的质量控制•目前大多数实验室都使用干粉培养基配置或使用成品培养基。对来自著名的微生物培养基生产公司的成品培养基，质量比较稳定。只要按要求储存，在有效期内使用可获得满意效果。对自制•的培养基应进行严格的质量控制。•（一）原材料的挑选:制作培养基的原材料成分复杂，应选用成分稳定的试剂，化学试剂应选用分析纯制作MH琼脂的原材料，尚有对胸腺嘧啶和Ca2+、Mg2+等离子浓度的要求。使用干粉培养基配制时，应对每一批号的干粉培养基进行登记并进行以下的质控程序。•（二）配制过程:按照实验室操作手册中,培养基的配制方法、配制步骤和注意事项严格进行。作好配制记录及培养基上的标签，注明培养基的名称、配制量、配方、配制者、配制日期及有效期。•（三）质量控制•1.培养基的外观检查：首先观察其颜色和透明有•无异常，液体培养基应清晰透明，若有混浊与沉淀，说明培养基污染或成分析出；固体培养基应光滑湿润、色泽均匀、无干裂，否则不能使用。•普通琼脂平板2~8℃可储存1~2周，血平板至多储存1周。培养基与容器边缘分离则应弃去不用。•2.无菌试验：培养基灭菌后，应对每批培养基灭菌效果进行检测。对于分装后进行灭菌的培养基一般应随机抽取5%的量，置于35℃孵育箱中24h,无菌生长为合格；对于无菌手续分装的培养基则应对全部培养基置于35℃孵育箱中24h，进行无菌试验；对选择性培养基，应取部分培养基加入10~20倍的无抑制性肉汤，稀释抑制物质，•置于35℃孵育箱中24h,无菌生长为合格。•3.培养基的量：在容器中装入太多或太少的培养基均不合适。一般而言，斜面培养基的长度不超过试管的2/3。双糖铁琼脂培养基，高层最少要有1cm。MH琼脂平板的厚度为4mm，即直径为90mm的平皿，注入25ml的培养基即可。其它平板厚度一般为3mm，在90mm直径平皿中注入15~20ml的培养基。•4.培养基的pH:配制的培养基pH应与规定的pH相差在±0.2之内，应在室温条件下用pH测定。不宜用试纸法或目视比色法测定。•5.性能试验：应根据培养基的种类不同,分别用已知阳性和阴性的标准菌株或参考菌株对每一批•新配制或新购入的培养基进行测试，符合要求方可使用。•用于测定各种培养基性能的菌种如下：•培养基质控菌株判断标准•羊血琼脂平板金黄色葡萄球菌ATCC25923生长•生长试验大肠埃希菌ATCC25922生长•溶血反应肺炎链球菌ATCC19615生长，α溶血•化脓链球菌ATCC6305生长，β溶血•杆菌肽敏感化脓链球菌ATCC630510mm，敏感•（纸片法）B群链球菌10mm，耐药•Optochin敏感肺炎链球菌ATCC1961514mm，敏感•（纸片法）涎链球菌15mm，耐药•巧克力平板生长淋病奈瑟菌，肺炎链球菌生长•SS平板鼠伤寒沙门菌生长，菌落中心黑色•伤寒沙门菌，福氏志贺菌生长，无色透明菌落•大肠埃希菌部分抑制生长，红色菌落•肠球菌部分抑制生长•需氧血液增菌液肺炎链球菌，化脓链球菌生长•厌氧血液增菌液脆弱类杆菌生长•培养基质控菌株判断标准•麦康凯平板大肠埃希菌生长，红色混浊菌落•伤寒沙门菌生长，无色透明菌落•中国蓝琼脂大肠埃希菌生长，蓝色菌落•伤寒沙门菌生长，无色菌落•营养琼脂金黄色葡萄球菌大量生长•福氏志贺菌大量生长•厌氧血平板脆弱拟杆菌生长•产气荚膜梭菌生长，β溶血•弯曲菌琼脂空肠弯曲菌生长•大肠埃希菌部分抑制•TCBS平板霍乱弧菌生长，黄色菌落•副溶血弧菌生长，蓝绿色菌落•沙保弱琼脂白色念珠菌生长•大肠埃希菌部分或完全抑制•碱性蛋白胨水霍乱弧菌大量生长•大肠埃希菌抑制生长•各种鉴别培养基需每批及每月测试一次•各种鉴别培养基的测试菌种•培养基阳性对照菌阴性对照菌•赖氨酸脱羧酶迟缓爱德华菌费氏枸橼酸杆菌•鸟氨酸脱羧酶产气肠杆菌费氏枸橼酸杆菌•精氨酸双水解酶阴沟肠杆菌普通变形杆菌•蛋白胨水（靛基质）大肠埃希菌阴沟肠杆菌•葡萄糖磷酸盐蛋白胨水•MR大肠埃希菌阴沟肠杆菌•V-P阴沟肠杆菌大肠埃希菌•枸橼酸盐（西蒙氏）产气肠杆菌迟缓爱德华菌•苯丙氨酸脱氨酶雷极普罗威登菌费氏枸橼酸杆菌•O-F试验管（葡萄糖）铜绿假单胞菌（氧化型）洛非不动杆菌（不利用）•大肠埃希菌（发酵型）•硝酸盐还原大肠埃希菌洛非不动杆菌•胆汁-七叶苷粪肠球菌化脓链球菌•脱氧核糖核酸琼脂粘质沙雷菌表皮葡萄球菌•氰化钾肉汤产气肠杆菌迟缓爱德华菌•培养基阳性对照菌阴性对照菌•丙二酸盐产气肠杆菌迟缓爱德华菌•尿素琼脂雷极变形杆菌（快）大肠埃希菌•肺炎克雷伯菌（慢）•半固体动力试验大肠埃希菌肺炎克雷伯菌•用于测试分离培养基的菌株，原则上应使用预期最难生长的细菌菌种，并且应少量接种。如需观察多种性能，可使用多种菌株来完成。如：羊血琼脂平板，用已型溶血性链球菌观察透明溶血情况。用翠绿链球菌观察草绿色溶血情况。•选择性分离培养基，应能使目的菌生长，而其它菌受抑制不生长。选择性增菌培养基可使用一定比例的目的菌与其它菌的混合菌液接种，观察目的菌是否增殖，而其它菌生长受到抑制。•四、试剂、抗血清和染色液的质量控制•1.试剂及染色液：用于测定细菌各种生物学特性的试剂及染色液，必须注明配制或购入日期并注意有效期及储存条件。由于各种试剂及染色液的稳定性不一致，测试时应同时进行阳性和阴性对照试验。•各种染色液的监控菌株•染色液阳性对照菌阴性对照菌监控频度•革兰染色液金黄色葡萄球菌大肠埃希菌每天•萋-纳抗酸染色液结核分支杆菌每次•异染颗粒染色液白喉棒状杆菌每次•荚膜染色液肺炎克雷伯菌每批•鞭毛染色液普通变形杆菌福氏志贺菌每次•各种试剂的监控菌种•试剂阳性对照菌阴性对照菌监控频度•新鲜血浆（凝固酶）金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌每天•3%过氧化氢金黄色葡萄球菌A群化脓链球菌每天•新生霉素纸片金黄色葡萄球菌腐生葡萄球菌每批•“Ⅹ、Ⅴ”因子试剂条流感嗜血杆菌嗜沫嗜血杆菌每批，以后每周•氧化酶试剂铜绿假单胞菌大肠埃希菌每批，以后每次•靛基质试剂大肠埃希菌产气肠杆菌每批，以后每天•甲基红试剂大肠埃希菌产气肠杆菌每批，以后每周•V-P试剂产气肠杆菌大肠埃希菌每批，以后每周•硝酸盐还原试剂大肠埃希菌醋酸钙不动杆菌每批，以后每周•苯丙氨酸脱氨酶试剂奇异变形杆菌大肠埃希菌每批，以后每周•马尿酸钠水解试剂B群链球菌A群链球菌每批，以后每次•10%去氧胆酸钠肺炎链球菌涎链球菌每批，以后每周•2.抗血清的质量控制:抗血清的来源必须可靠,并根据使用说明使用与保存,并在有效期内使用。如使用过程中发现任何混浊或颜色改变，应弃去不用。第一次使用需用标准菌株监控，以后每月进行一次测定。•常用的抗血清和监控菌株•抗血清监控菌株抗血清监控菌株•肺炎链球菌肺炎链球菌D群宋内志贺菌•链球菌A群化脓链球菌沙门菌AFO多价沙门菌属、种•B群无乳链球菌A群：O2；a甲型副伤寒沙门菌•C群似马链球菌B群：O4；b；1，2乙型副伤寒沙门菌•D群粪链球菌O4；i；1，2鼠伤寒沙门菌•致病性大肠C1群：O6,7；K；1,2汤卜逊沙门菌•埃希菌多价Ⅰ大肠埃希菌O26:B6O6,7;c;1,5;vi丙型副伤寒沙门菌•多价Ⅱ大肠埃希菌O86:B7C2群：O6，8;d;1,2弗吉尼亚沙门菌•多价Ⅲ大肠埃希菌O18:B21D1群：O9；d；vi伤寒沙门菌•志贺菌属A群痢疾志贺菌O9；gm肠炎沙门菌•B群福氏志贺菌E群：O3,15;eh;1,6钮因顿沙门菌•C群鲍氏志贺菌F群：O11;i；1，2阿伯丁沙门菌•五、抗生素与抗生素纸片的质量控制•在微生物实验室有许多用于诊断的抗生素纸片，贮存不当易失效，应贮存于-20℃条件中。效期为一年，日常使用的抗生素纸片可贮存于4℃冰箱中，效期为一周。临床上常用的体外抗菌药物敏感试验有纸片扩散法和稀释法，这两种方法操作繁琐，影响因素多。因此抗菌药物敏感试验的质量控制显得尤为重要。•1.纸片扩散法药物敏感试验的质量控制•1）培养基:应使用合格的MH琼脂,每购进一批新的MH琼脂要使用标准菌株、已知在控的药敏纸片,用标准方法进行测试,符合要求才可使用。•培养基的制作应按照操作规程执行，各平板厚•度应为一致的4mm（相当于在直径为150mm的平皿中倾倒60~70ml,直径为100mm的平皿中倾倒25~30ml培养基)，无菌试验合格。普通贮存条件下（2~8℃）可使用7天。使用前将平板置于35℃孵育箱中30min，使培养基表面过多的残留水分蒸去。保存过久，脱水的平板不应使用。•室温下的MH琼脂的pH应为7.2~7.4，pH值过低，可降低氨基糖苷类和大环内酯类抗生素的抗菌活性，增强青霉素类抗生素的抗菌活性，使试验结果可信度降低。•MH培养基中胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量尽可能低，以防止过量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶抵消磺胺类和甲氧苄胺嘧啶的抗菌效应，抑菌环•缩小甚至消失，导致假性耐药报告。可用磺胺甲基异噁唑/甲氧苄胺嘧啶纸片对粪肠球菌ATCC29212或ATCC33186在MH琼脂平板上进行测试，如有清晰的抑菌环,直径≥20mm，则为胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量合格。•对于在MH琼脂平板上不能生长的菌株应使用改良的培养基,如嗜血杆菌属用HTM培养基,肺炎链球菌和其他链球菌应用加有5%羊血的MH琼脂培养基进行药敏试验。•2）菌悬液的浓度标准：用于纸片扩散法的菌悬液浓度为1.5×108CFU/ml,相当于麦氏浊度管0.5管浊度。•3）含药抗生素纸片：纸片的含药量高低是影响•抑菌环大小的主要因素，纸片的直径、厚度、吸水性、纸片本身的酸碱度等与纸片含药量均有密切关系。以冷冻干燥法制备的质量最好，每张纸片的含药量一致。•药敏纸片含药量检测：取同一批号的药敏纸片7片，按Kirby-Bauer法用适宜