激光共聚焦显微镜在细胞骨架研究中的应用

激光共聚焦显微镜在细胞骨架研究中的应用摘要随着生物技术研究的不断发展，对观察细胞形态所使用的仪器要求也越来越高，普通光学显微镜已经无法满足研究的需要，激光共聚焦显微镜的产生从一定程度上弥补了光学显微镜的不足。激光共聚焦显微镜具有分辨率高、灵敏度高、放大率高等优点，使得它在形态学、分子细胞生物学，神经科学、药理学、遗传学等领域研究中成为有力工具。本文就其在细胞骨架的研究方面做一简要综述。关键词激光共聚焦显微镜细胞骨架LaserScanningConfocalMicroscopeinthestudyofcellskeletonAbstractWiththedevelopmentofbiotechnologyresearch,instrumentationrequirementsforcellmorphologywasobservedbeingusedincreasinglyhigh,ordinaryopticalmicroscopehasbeenunabletomeettheneedsofthestudy,thegenerationoflaserscanningconfocalmicroscopeopticalmicroscopetomakeuptosomeextentfromtheinadequate.Laserscanningconfocalmicroscopewithhighresolution,highsensitivity,magnificationadvantages,makingitapowerfultoolintheresearchfieldmorphology,molecularcellbiology,neuroscience,pharmacology,genetics,etc..Inthispaper,abriefoverviewoftheirresearchinthecytoskeleton.Keywordsconfocalmicroscopycytoskeleton所谓激光共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscope，简称LSCM)与传统显微镜相比，它具有分辨率高、灵敏度高、放大率高等优点，可以在细胞水平上进行多种功能的测量和分析，得到具有三维清晰度的原色图像，而且它还可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏。随着软件开发和应用技术的不断完善，激光扫描共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学，神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具[1-2]。正是由于激光共聚焦显微镜在细胞学中有很大的应用范围，本文就其在细胞骨架方面的研究做一简要综述。1.LSCM的原理1.1普通光学显微镜的原理普通光学显微镜的成像系统由产生物像的光学系统(目镜和物镜)、照明系统和机械支架三部分组成。其中目镜和物镜都是具有放大成像功能的凸透镜。显微镜的放大倍数与每个凸透镜的放大倍数密切相关。当物体与物镜的距离小于焦距时，在物体的同一侧形成的是正立放大的虚像。当物体与物镜的距离在1—2倍焦距之间时，在物镜的另一侧形成倒立缩小的实像。所观察的物体位于物镜的焦点的前方(1—2倍焦距之间)，在物镜的另一侧形成一放大、倒立的实像于目镜焦点以内(即在目镜的单倍焦距内)，此物像通过目镜的再次放大，得到虚像。此物像比眼睛直接看到的物体AB要大得多，所以使用显微镜可以看清非常微小的物体[3]。不过显微镜的分辨率受到一些物理因素的影响，主要有球差和色差两个方面。所谓球差，是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦。以至透过标本一点的光线通过透镜后，不能聚焦成一点，而是形成一个光斑，从而使成像模糊不清。所谓色差，是由于显微镜对不同颜色的光线具有不同的折射率造成的。因为不同颜色的光具有不同的波长，透镜类似于三棱镜，对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后。不同颜色的光聚焦在不同点上，从而使成像模糊，而且像的边缘尚带有色彩。1.2LSCM基于光学显微镜的改进[4]1.2.1用激光做光源因为激光的单色性非常好，光源波束的波长相同，从根本上消除了色差。1.2.2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差；并进一步消除了色差。1.2.3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像，再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的，标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。1.2.4用计算机采集和处理光信号，并利用在共聚焦显微镜中，计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管，可以将很微弱的信号放大，灵敏度大大提高。1.3LSCM的原理[5-7]LSCM是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针产生信号，并利用计算机进行图像处理，获得高分辨率、高质量的图像的显微镜。LSCM主要由激光光源、扫描器（内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光滤光片及检测器）、荧光显微镜（装有微量步进电动机）系统、光学装置、计算机存储与处理及控制系统等部分组成。通过针孔成像作用，还可以对样品进行直接无损伤的光学断层扫描，进而实现立体结构的三维重建以及空间结构和荧光强度信息。传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰；激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡，由探测针孔后的光电倍增管逐点接受，在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。所以照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，也就是说照明针孔与探测针孔具有共同的焦平面。在载物台上加一个微量步进马达，使载物台沿垂直方向(Z轴)上下步进移动，将样品新的一个层面移到焦平面上，这个层面又成像在显示器上，随着z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光学图像，实现“光学切片”的目的，被形象地称为显微“CT”，在此基础上计算机系统自动进行三维重建。与此同时LSCM也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。2.激光共聚焦显微镜在细胞骨架研究中的应用2.1激光共聚焦显微镜在活细胞的细胞骨架研究中的应用微丝（microfilaments，MF），又称肌动蛋白纤维（actinfilament），是真核细胞中由肌动蛋白（actin）组成，直径7nm的骨架纤维。参与细胞内的多种生理活动，如胞质流动，肌肉收缩，细胞分裂，细胞颗粒的运输等，维持细胞的形状，参与细胞顶端生长，细胞壁构建，细胞器定位等[8]。微丝骨架通常是通过迅速的聚合解聚来调整和改变其形态，从而在细胞执行各种功能及应对外界刺激时维持细胞正常的生理活动。细胞中的微丝骨架的动态变化直接受肌动蛋白结合蛋白（actin-bindingproteins,ABPs）的调节。ABPs通过与单体肌动蛋白（G-actin）或丝状肌动蛋白（F-actin）结合，调节二者之间的动态平衡，进而调控微丝骨架的组织和功能。ABPs的活性又受诸多其他因素的调控，诸如Ca2+、pH、磷酸化等等，因此微丝骨架能通过ABPs对细胞内外信号作出的反应，从而参与细胞内的各种生理活动[9]。细胞内微丝骨架是高度动态的网络结构，采用合适的标记探针对体内的微丝骨架进行标记、获得可视化效果强的图像，是研究体内微丝骨架形态结构及动态变化的重要前提。随着发光蛋白的发现，植物体内微丝骨架的标记方法也从利用微丝的特异性药物向着构建发光蛋白与某种可以特异结合微丝的蛋白或肽段构成的融合蛋白方向发展。Kost等人最先使用GFP与小鼠talin蛋白C端的肌动蛋白结合结构域构成融合蛋白（GFP-mTn）在植物体内标记微丝[10]。随后，Timmers将GFP与一种微丝结合蛋白——拟南芥丝束蛋白1（AtFIM1）构成融合蛋白（GFP-AtFIM1）用于标记微丝[11]。也正是由于这些发光探针的使用，结合激光共聚焦显微镜的使用，才使得对于细胞骨架系统的研究越来越透彻，一步步揭示出细胞骨架的奥秘。2.2激光共聚焦显微镜在凋亡细胞研究中的应用近年的越来越多的研究显示，微管在细胞凋亡过程中也起着非常重要的作用[12-13]。细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞主动死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡细胞在形态上出现变圆皱缩、染色质浓缩边集、核碎裂、凋亡小体形成等变化，并最终由非炎症过程清除。由于细胞凋亡独特地影响着机体的细胞发育和代谢。在监测和清除肿瘤细胞与突变细胞等方面也可能发挥重要的作用。在细胞凋亡的研究中，LSCM以其独特的优势已被广泛地应用于监测重要生理改变的方面。新型检测细胞凋亡主要有以下几种方法：电镜观察、荧光及普通光学显微镜观察、DNA凝胶电泳、流式细胞术、原位缺口末端标记(insitunick—endlabeling，TUNEL)DNA断片化分析以及凋亡过程蛋白因子、酶活性检测等。目前认为凋亡细胞特异性的形态学改变仍是判断细胞凋亡的最直观可靠的指标。过去对细胞凋亡的形态学研究方法局限于活性细胞和组织切片染色、荧光镜观察．或者石蜡切片原位末端标记法。由于普通光镜的分辨率和清晰度有限，且更多局限于对切片的观察，而电镜又显然不适合对凋亡这一复杂动态过程的监测．激光扫描共聚焦显微镜可对活细胞清晰成像的特点。使其在对细胞凋亡的形态学观察分析中倍受重视。观察发现，细胞微管的形态随细胞凋亡的发展发生相应的改变，凋亡早期微管的分布发生改变，逐渐凝聚成无功能的团块状，因此也伴随细胞骨架的功能改变，细胞逐渐失去其原来的细胞形态，到凋亡晚期，微管结构降解，细胞骨架塌陷，在共聚焦显微镜下，细胞荧光着色变浅，分布减少，细胞更加扁平，因此，细胞凋亡的发生、发展，与细胞骨架有着极其密切的关系，共聚焦显微镜在此之中发挥着不可替代的作用[14]。3.小结通过多篇文献的反映，激光共聚焦显微镜呈现出一系列的优点，比如：有利于多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集，无损伤连续光学切片图像的采集一显微“CT”，三维图像重建，可以对感兴趣区域的扫描，定位、定量测定等等。这些优点的应用不仅仅可以使激光共聚焦显微镜在细胞骨架方面有所研究，还会对其他一些方面有所帮助，通过激光共聚焦显微镜得到的丰富的实验数据，有利于支持我们的实验研究。同时，充分运用LSCM所携带软件的定量分析功能对所获得的图像进一步分析统计，也会为我们的实验结果增添可信之处。对已获得的实验相关图像进行量化和统计分析得到更加直观的信息，这在科学研究中也越来越重要，而LSCM软件的强大功能就能使这些复杂的数据统计变的简单而易懂。所以，在实验过程中我们还要充分利用LSCM所携带软件的各种功能为的研究工作提供更多信息。但是激光共聚焦显微镜也有一些不得不说的缺点，如价格昂贵，对操作人员技术要求高等，这也限制了它在一些领域中的应用[15]。总而言之，我们相信，LSCM应用于科学研究之后为生命科学所开拓的实时观察活细胞的结构和特定分子、离子动态生物学变化的途径，随着新软件的不断开发及各个学科的不断发展和相互渗透，必将有更广阔的发展前景。参考文献[1]王珺,王燕,龚坚.唐微激光共聚焦显微镜的应用技术.现代仪器,2009,15(4)[3]朱国荣.解析光学显微镜使用中遇到的几个问题,2012.2[2]朱珊珊,黄志江.激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究中的应用.2005(02)[4]赵启韬,苗俊英.激光共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用,北京生物医学工程2003,22(1)[5]周疆明,程路明,贾宏涛.显微镜技术研究进展[J].新疆农业科学,2006,43(S1):53-56.[6]李楠.激光扫描共聚焦显微技术[M].北京:人民军医出版社,1997:68.[7]童应鹏,张艺,张静