激光共聚焦显微镜(研究生)1

生物物理教研室陈丽娜激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）授课内容一、LSCM的发展与现状二、LSCM的成像原理及组成三、LSCM的使用步骤四、LSCM的基本功能五、LSCM在生物医学领域中的应用1957年，MarvinMinsky提出共聚焦原理；1978年，Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜；1982年，BIO-RAD公司第一个推出商品化激光扫描共聚焦显微镜；1985年，WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章；1987年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状仪器名称生产商型号BD高通量活细胞共聚焦分析系统400系列美国BD公司Pathway415、Pathway435BD高通量活细胞共聚焦分析系统800系列美国BD公司800系列BD全光谱活细胞共聚焦高速扫描系统美国BD公司CARVⅡ尼康共焦显微镜尼康（Nikon)C1共焦激光扫描显微镜徕卡仪器有限公司LeicaTCS-SP2OLYMPUS激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV300OLYMPUS激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV1000NIKON共聚焦显微镜尼康（nikon)尼康（nikon）C1-plusUltraView™高速扫描型激光共聚集系统PerkinElmerUltraView™高通量共聚焦显徽细胞图像分析测定系统GEHealthcareINCellAnalyzer3000时间分辨激光共聚焦显微成像系统德国耶莱公司TauMap德国ZEISS激光共聚焦显微镜德国ZEISSLSM510SYSTEM德国ZEISS激光共聚焦显微镜德国ZEISSLSM510PASCALSYSTEMFluoView™FV1000共聚焦显微镜FV1000系统完美地整合了两套相互独立的扫描模块在一套系统内，在一束激光进行实验刺激的同时，另一束激光实时地对样品进行扫描，从而记录完整的动态变化过程。美国Meridian公司的ACASuLTIMA312为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。BIO-RAD公司第七代Radiance2100型激光扫描共聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜1）激光光源2）计算机系统3）共聚焦系统4）光学探测系统5）图像分辨率6）扫描方式激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统硬件系统软件系统1）、ImageAnalyze2）、RatioAnalysis和Kinetics3）、Cell–CellCommunicationandFRAP4）、CellList5）、CellSorting6）、ConfocalImagingMitoticcells,multiplefluorescence(NCIMaryland)激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域新一代强有力的研究工具。二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成1、LSCM的基本结构荧光显微镜系统及样品台激光光源扫描器图象存储及处理系统LSCM各部分相互关系示意图计算机控制系统控制共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较计算机数字图象处理分析系统普通光学显微镜场光源干扰激光扫描共聚焦显微镜激光光源共轭聚焦原理和装置照相LightMicroscopyAC.elegansEmbryoGatpro-nucleimeetingGstage(beforedividinginto2-cellembryo)DifferentialInterferenceContrast(DIC;Nomarski)LaserScanningConfocalMicroscopy(LSCM)MultiphotonFluorescenceExcitationMicroscopy(MPFE)2、LSCM的工作原理激光束扫描器接收器计算机载物台的升降“光学切片”“细胞CT”LSCM组成光路的示意图Beampathintheconfocallaserscanningmicroscope共聚焦原理示意图（一）激光光源（1）、激光谱线（2）、激光器开闭和电压调节（3）、激光强度回馈稳定电路设计（4）、辅助设备波长（nm）功率(mW)激光器类型32510～30氦镉(He-Cd)激光351300带紫外的水冷式氩离子激光36420风冷氩离子激光（Ar-ion）44211氦镉激光457～51425小型氩离子激光5431.25绿氦－氖(He-Ne)激光63033外谐振器半导体激光6303碰撞脉冲染料激光6323.5氦－氖激光700～11002000蓝宝石激光11521氦－氖激光（二）扫描器扫描器针孔光栏（pinhole）分光镜发射荧光分色镜检测器1）针孔光栏2）分光镜作用位置位置作用3）发射荧光分色镜4）检测器位置作用位置作用扫描装置光束扫描台阶扫描扫描方式原理优缺点激光共聚焦显微镜的基本结构扫描系统（1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微镜相连，与所接显微镜一体化设计（2）、检测器数量（3）、共聚焦针孔（4）、扫描分辨率及灰度级（5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）50-300微米（6）、光谱扫描功能（7）、扫描速度及速度调节（8）、扫描方式XYZtλ任意组合①点扫描②线扫描③Xλ扫描④平面扫描⑤XYλ、XZλ扫描⑥xyz,xyzt扫描⑦局部放大扫描⑧光谱模式下，多通道同时扫描。（9）、扫描旋转、光学放大（变倍）（10）、可即时或延时进行扫描（11）、有线和帧方式的多重扫描功能ROI(regionofinteresting，感兴趣区域）实时（realtime）显示（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置（13）、有记忆功能（14）、有专用的图象数据库（15）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩展和升级换代Drosophilaembryo,brain,3DProjection-extendeddepthoffocus“(Prof.Reichert,LaborNeurobiologieUniversityofBasel)（三）光学系统（显微镜）⑴、倒置荧光万能显微镜⑵、显微镜上的外接接口⑶、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达⑷、荧光镜座要装有防振动装置⑸、装有光路转换装置⑹、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜⑺、载物台支架和附件的配置(10)、≥4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长⑼、荧光显微镜的参数要与光路系统、计算机控制软件系统相匹配⑻、汞灯光线的强度可调荧光源单光子激励（左），多光子激励（右）激发荧光能量图单光子（λ1）单光子（λ2）双光子（λ2）单、双光子激发产生荧光过程的示意图101hcEE2012hcEE201hcEE荧光荧光荧光光谱分隔发射的荧光Separationoffluorescenceemissionsbymeansofdichroicfilters（四）计算机系统控制硬件的软件功能：①控制电动显微镜；②选择激光波长，调节激光强度；③拍摄2-5维图像；④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片位置。应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用等）：①多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVI文件，Average拍摄模式提高信噪比；②荧光强度动态分析，动态显示，Ratio值测量（钙离子等）；③FRAP/FLIP；④线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；⑤图像调节亮度，对比度，Gamma；单个通道分别调节或多个通道同时调节；⑥图像处理：旋转，裁剪，多种滤镜（Kirsh/Laplace/Lowpass/Median），添加标尺，箭头，文字等；⑦图像分析：直方图，距离，强度，强度断面分布；⑧VBA模块：宏功能，可以录制，编辑，回放，实现自动操作；⑨多种视图：1D，2D，正交视图，图片叠加等；⑩光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能量共振转移）软件包。三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤（一）样品制备1．组织切片标本实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。2．细胞标本细胞种类和纯度，细胞密度和形态。3．承载细胞的器皿Petri皿和玻片。（二）荧光探针的选择标记生物样品的探针大约分为：1）蛋白质、单糖和多糖探针；2）细胞器探针；3）核酸探针；4）细胞活性探针；5）膜和受体探针；6）细胞膜电位和细胞内pH探针；7）金属探针；8）分子的特殊基团结合探针；9）其他（4）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。（三）仪器使用步骤（1）、选择激光器类型（2）、选择相应的滤片（3）、根据实验目的选择适当软件Xy观察模式的图象获得设置染色方法显微镜和扫描的配置设置物镜放大率设置变焦率为1x设置所需通道设置最高扫描速度设置xy观察模式执行重复扫描校正对于确定z位置观察所需复合的各部分条件设置观察范围校正图象亮度设置较低的扫描速度重新校正图象亮度停止重复扫描获得图象储存图象1）DNA用Hoechst33342标记（蓝），2）细胞膜用NBD-PC染色（绿），3）线粒体用Mitotracker标记（红）三重荧光染色图谱：活HT细胞1、“更多信号！”1）、通过减慢扫描速度2）、使用“平均”方法3）、增加发射滤镜的带宽4）、加大针孔直径；注意：光学切片的厚度也会相应地增大。5）、增大激发能（激光功率）；注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。如何改善图像质量3、“更可靠！”1）、使用多轨2）、提供预定义配置。3）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。2、“更多细节！”1）、使用较高数值孔径(NA)的物镜2）、增加“帧大小”=每条线的像素值+每帧的线条数3）、优化扫描焦距(Z)4）、增加动态范围Culturedcells,multiplefluorescence(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)Cellculture,3Dshadowprojection(calculatedbyImaris,BitplaneAG,Zürich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能主要功能采集图像定量测定相关参数荧光信号定性定位观察（一）采集和处理图像1、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像LSCM的成像特点：（1）、保持样品的完整性。（2）、采集多重（波长）荧光分解及合成（overlay）图像。（3）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利于形态学观察。（4）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（regionsofinterest，ROI）和深度进行扫描。（5）、获取三维重建图像2、获取透射光及反射光图像有、无荧光的样品均可以用LSCM采集到其透射光图像。（二）荧光分子的定性及定位1、定性鉴定待测荧光物质2、荧光信号的定位（1）、单荧光定位（2）、多重荧光标记共定位（3）、荧光与透射光共定位Confocalmicrographofmilkshowingmilkprotein(green),fat(blue),sugarcrystals(black)andcoco