灭菌与灭菌技术.

灭菌与灭菌技术江苏大学药学院朱源第一节概述需要灭菌的制剂：直接注入机体或与粘膜、创面接触的药剂无菌（Sterility）：是指物体或任一给定的介质中，没有任何活的微生物存在或无论用任何方法都鉴定不出活的微生物来灭菌（Sterilization）：应用物理或化学等方法把物体上或介质中所有的微生物及其芽胞全部杀死，即获得无菌状态的总过程消毒（Disinfection）：用物理或化学等方法杀灭物体上或介质中的病原微生物（除了芽胞）防腐（Antisepsis）：用物理或化学等方法抑制微生物生长的作用，称为防腐或抑菌热原（Pyrogens）：热原是微生物的一种内毒素，存在于细菌的细胞膜与固体膜之间，能够引起人或动物体温的异常升高。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌所产生的热原无菌操作法（Aseptictechnique）：是指在整个操作过程中利用和控制一定条件，尽量使产品避免微生物污染的一种操作方法细菌的耐受性致死温度：是指在一定的时间内，杀死某种细菌所需要的最低温度致死时间：是指在某一温度下，杀死某种细菌所需要的最短时间，又称热死时间灭菌和除菌对制剂的影响灭菌后的制剂中含有细菌的尸体，尸体过多会因菌体内毒素（热原）而引起副作用除菌是指用特殊的滤材把微生物（死菌、活菌）全部阻留而滤除，除了原已染有的微量可溶性代谢产物，由于没有菌体的存在，故没有更多的热原产生不同菌种的耐热性芽胞抗高温的原因•芽胞壁厚而致密，热力不易透入芽胞内•芽胞内水分含量少，加热时蛋白质不易凝固，酶不易失去活性•芽胞内含有吡啶2，6-二羧酸钙，它与蛋白质结合成耐热的复合体第二节微生物死亡动力学的研究实质•是寻找对灭菌效果可靠的验证参数原因•灭菌温度多是测量灭菌器内的温度而不是灭菌物体内的温度•现行方法不易检出残存的微生物一、D值D值是指降低微生物数至原来的10％或降低一个对数单位所需的时间或剂量，也就是杀灭90％微生物所需的时间或剂量D=U/（lgN0-lgNu）•U为在一定灭菌条件下灭菌经历的时间或接受的剂量；N0为微生物的初始数量；Nu为接受了U单位时间或剂量的灭菌后微生物的数量；Nt为t时间微生物的残留数量热力灭菌或直接用钴-60辐射灭菌二、Z值不同温度下对特定的微生物在特定介质或环境中求得D值后，就可用lgD对温度作图Z=（T2-T1）/（lgD1-lgD2）表示降低一个lgD值所需升高的温度，及灭菌时间减少到原来的10％所需升高的温度三、F值与F0值F=△t∑10T-T0/Z△t是测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.5～1.0分钟或更小；T是每个时间间隔△t所测得的被灭菌物料的温度，T0是参比温度F值是指在一定温度T下给定Z值所产生的灭菌效力与在参比温度T0下给定Z值所产生的灭菌效力相同时，T0温度下所相当的灭菌时间F值适用于干热灭菌F0值-物理F0值在湿热灭菌条件下测定的，且以嗜热脂肪芽胞杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃下，Z值为10℃F0=△t∑10T-121/10F0为一定灭菌温度T，Z值为10℃时所产生的灭菌效力与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效力相同时所相当的时间F0值将各种灭菌温度使微生物的致死力转换为灭菌物品完全暴露于121℃对微生物的致死效力，所以F0值又称为标准灭菌时间，适用于热压灭菌法F0值-生物F0值将F0值看作是D121值与微生物数量对数降低值的乘积F0=D121×（lgN0-lgNt）其中Nt为灭菌后预期达到的微生物残存数，又叫染菌度概率，一般取Nt为10-6生物F0值可认为是以相当于121℃热压灭菌时杀死容器中全部微生物所需要的时间例如，将含有200个嗜热脂肪芽胞杆菌的5％葡萄糖水溶液以121℃热压灭菌时，其D值为2.4分，则F0=2.4×（lg200-lg10-6）=19.92min由于F0是将不同灭菌温度折算到相当于121℃湿热灭菌时的效力，故F0值可作为灭菌过程的比较参数为了使F0测定准确，先应选择灵敏度高，重现性好，精密度为0.1的热电偶，并对热电偶进行校验灭菌时应将热电偶的探针置于被测物的内部，经灭菌器通向柜外的湿度记录仪，有些灭菌记录仪附有F0显示器，在灭菌过程中和灭菌后，自动显示F0值影响F0值的因素容器的形状、大小、热穿透系数灭菌产品溶液粘度、容器充填量容器在灭菌器内的数量与排布•注意灭菌器内各层、四角、中间位置热分布是否均匀，以便合理排布为了确保灭菌效果，还应注意两个问题：根据生物F0值的计算公式，若N0越大，即被灭菌物中微生物越多，则灭菌时间越长，故生产过程中应尽量减少微生物的污染，应采取各种措施使每个容器的含菌数控制在10以下计算F0时，应适当考虑增加安全因素，一般增加50％，如规定F0为8分，则实际操作应控制F0为12分药剂学中灭菌法可分为三大类：即物理灭菌、化学灭菌、无菌操作法。第三节物理灭菌法一、热力灭菌法（Thermalsterilization）加热可破坏蛋白质和核酸中的氢键，故导致核酸破坏，蛋白质变形或凝固，酶失去活性，微生物因而死亡热力灭菌法分为干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下，湿热灭菌的效力比干热灭菌大细菌在湿热下，菌体吸收水分，蛋白质较易凝固。这点可以从鸡蛋白含水量与凝固温度之间的关系看出来，凝固蛋白质所需要的温度与蛋白质的含水量有关湿热的穿透力比干热大湿热灭菌时，水蒸气与物品接触而凝结成水，因而发出潜热（汽化热），加速细菌的死亡鸡蛋白含水量与凝固温度关系表(一)干热灭菌法火焰灭菌法灼烧是最迅速、可靠、简便、紧急的灭菌方法金属品如铂丝、铁或镍制。不锈钢制的刮刀、镊子等，瓷制品如研钵等，玻璃制器皿如玻棒、载玻片、试管等的灭菌都可用此采用该法灭菌时，最少须在火焰中加热20秒，通常是要将灭菌的物品迅速通过火焰3～4次。对研钵的简便灭菌方法是在其中加入少量乙醇点火燃烧；对于玻璃、瓷制品，操作前应充分干燥，以免烧灼时炸裂损坏干热空气灭菌法本法系指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法本法并不是一种优良理想的灭菌方法，其原因是干热空气的穿透力很弱而不均匀；另外，空气的比热低，是一种不良的传热介质。因此须长时间受高热的作用才能达到灭菌的目的加热温度及时间根据灭菌器和灭菌物性质的不同而异，目的是达到微生物残留量在10-6以内。根据中国药典规定，干热灭菌条件一般为：160～170℃≥120min、170～180℃≥60min上或250℃≥45min对于磺胺等遇高热熔化或容易分解的药物或对热敏感的材料，应采用较低温度与较长时间灭菌对耐热物品可采用较高的温度和相应较短的时间凡应用湿热方法灭菌无效的非水性物质，或极粘稠的液体如甘油、液体石蜡、油类等药物也可以采用此法药物的干热空气灭菌对玻璃容器或瓷制与金属制的容器灭菌时，必须先洗净，不使其沾染有油脂或其他有机物质，然后用适当的包装材料包裹烧瓶或其他容器口上用棉花塞密，外面再覆以纱布或一层坚韧的纸，置干热空气灭菌器中，160℃灭菌2小时以上空安瓿的灭菌，可置于密盖的金属盒中，用200℃或200℃以上的高温保持至少45min以上，当温度达到250℃时，灭菌45min后，热原也可以被破坏器皿的干热空气灭菌(二)湿热灭菌法本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法本法是制剂生产中应用最广泛的一种灭菌法具有可靠、操作简便，易于控制和经济等优点。缺点是不适用于对湿热敏感的药物影响湿热灭菌的因素微生物的种类和数量各种细菌对热的抵抗力相差很大，处于不同发育阶段，所需灭菌的温度与时间也不相同繁殖期间的微生物对高温比衰老时期的抵抗力小得多最初菌数越少，越能短时间内达到灭菌，同时，如果最初菌数多，即使细菌全部杀灭，而药液中细菌尸体、热原过多，亦会引起不良反应介质的性质溶液中若有营养性物质如糖类、氨基酸等，对微生物有营养保护的作用，能增强其抗热性细菌的生活能力也因介质的酸碱度而不同，一般微生物在中性溶液中耐热性最大，在碱性溶液中次之，酸性则不利于微生物的发育药物的性质一般说，灭菌所需时间与温度成反比。但是药液温度增高，药物分解的反应速度也增加。所以在杀灭细菌的前提下，可适当降低灭菌温度或时间比如，维生素C注射液用流通蒸汽15min即可达到灭菌，氯化钠输液用115℃，30min进行灭菌蒸汽的性质湿饱和蒸汽：即饱和水蒸汽中带有水分，常由于蒸汽输送管路中热量损失所形成的，因此在蒸汽中混悬着无数微细水滴，此种蒸汽的热含量较低，穿透力较差，故灭菌效力较低饱和蒸汽：即蒸汽的温度与水的沸点相当，当蒸汽的压力达到平衡时，蒸汽中不含有微细的水滴。饱和蒸汽热含量较高，潜热大，穿透力较大，因此灭菌效力也较大过热蒸汽：如在热压灭菌器中的水不足，液体状态的水完全蒸发后，再继续加热即生成过热蒸汽，这种蒸汽与干热状态相似。在压力不变、温度继续上升的情况下此温度虽比饱和温度高，但穿透力很差，因此灭菌效力不如饱和蒸汽不饱和蒸汽：若灭菌器内空气未排尽，则蒸汽为不饱和蒸汽，内含不同比例的空气，由于空气是热的不良导体，空气与被灭菌的物体接触后又无潜热放出，故灭菌效力降低1、热压灭菌法本法系在热压灭菌器内进行的用高压饱和蒸汽加热杀灭微生物的方法。是常用的湿热灭菌法热压灭菌器有密盖，可以使饱和蒸汽不逸出，由于蒸汽量不断增加而使器内压力增大，此法有很强的灭菌作用如在表压1.05kg/cm2的饱和蒸汽（达121.3℃）经过20min，能杀灭所有细菌繁殖体和芽胞热压灭菌所需的温度及与温度相当的压力及时间如下：①115℃，1.7atm（67kPa，7.1kg/cm2），30min②121℃，2.0atm（97kPa，11kg/cm2），20min③126℃，2.4atm（139kPa，14.1kg/cm2），15min湿热灭菌一般要求F0=1～12分卧式热压灭菌柜•必须使用饱和蒸汽•必须排尽灭菌柜内空气•灭菌结束后，应待压力降至零后，缓慢打开柜门后取出样品•灭菌时间必须由全部药液达到灭菌温度时算起热压灭菌器内灭菌温度检查法①碘淀粉温度指示纸•取碘和碘化钾各0.5g，淀粉25g，加水至300ml使成糊状，然后将滤纸条浸入，取出干燥，装入安瓿内熔封，检查时与产品一起灭菌，经灭菌后，观察纸条，如果温度超过114℃～115℃则纸条的蓝色褪为白色，说明灭菌器内温度已到115℃②熔融温度指示剂利用某些化学药品，其熔点正好是灭菌所需温度，可以作为温度指示剂取这样的药品结晶少量密封于安瓿中，与待灭菌制剂同置于灭菌器中，观察指示剂是否熔化来判断灭菌温度常用的温度指示剂有焦性儿茶酚（140℃）、氨基比林（107～109℃）、安替比林（110～112℃）、乙酰苯胺（113～114℃）、升华硫（117℃）、苯甲酸（121℃）、β-萘酚（121℃）等在指示剂中加入少许亚甲蓝或苏丹红可以方便观察其熔变情况③留点温度计其结构原理与体温表类似，温度指示最高为140℃与一般体温计不同的是当灭菌器内温度达到最高并降低以后，水银面不会随着温度下降而是留在最高点指示灭菌温度达到的最高点④自动记录热电偶自动记录灭菌器内温度的变化和时间。分布于灭菌器不同的水平面和垂直面，探测热量的分布脉动真空蒸汽灭菌柜适合对药棉、纱布、手术无菌衣、医疗器械等灭菌。能自动抽真空，可有效地从多孔性物质中驱除空气，并在真空条件下通入水蒸汽，利用饱和蒸汽进行灭菌。灭菌结束后，内层再一次抽真空，把蒸汽从灭菌物品中抽出，而夹层中仍然通有蒸汽，便于物品的干燥快速冷却灭菌器适合对玻璃瓶装液体（注射剂、大输液）进行自动真空饱和蒸汽灭菌，并附有喷淋冷水装置，在灭菌时间达到后，可喷淋冷却，使被灭菌物迅速冷却，利于药品的稳定软包装灭菌器适合对软包装液体（软塑料装大输液、袋装食品）进行蒸汽灭菌。自动抽真空，饱和蒸汽灭菌后，附有喷淋冷水装置，灭菌结束后迅速冷却，利于药品食品的稳定2、流通蒸汽灭菌法流通蒸汽灭菌是在不密闭的容器