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灵芝酸的纯化及其应用摘要：灵芝酸是灵芝中除多糖外另一类具有广泛生理活性的物质，被证明具有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、抗肿瘤等活性。研究还表明结构类似的单体灵芝酸具有不同的生物活性。由于其重要的药理作用，近年来灵芝酸成为国内外研究的一个热点。ThePurificationandApplicationofGanodericAcidsAbstract:Ganodericacids(GA),productionbyGanodermaLucidum,isaphysiologicalactivecompoundsandappliedinacesodyne,nervoussystem,antihistaminicactivity,liverprotectionantitumeretc.RecentresearchhasalsoshownthatdifferentindividualGAshavedifferentactivities.DuetotheimportantpharmacologicalfunctionsofGAs,theinterestinG.lucidumhasincreasedaroundtheworldinrecentyears.一、国内外技术现状和发展趋势1.灵芝的经济价值、营养价值和保健功能1.1灵芝的经济价值在自然界中，灵芝多生长于森林中树桩或朽木上，对环境要求比较严格。《别录》中记载灵芝的产地为霍山、恒山、泰山、华山、篙山、高夏。现在灵芝主要来源于多孔菌科植物紫芝和同属植物赤芝。紫芝主要分布于浙江、江西、湖南、广西、福建、广东等省区，赤芝主要分布于河北、山东、山西、四川、安徽、江苏、浙江、江西、贵州、云南、广西、福建、广东等省区，生于栋及其它阔叶树的根部或枯干上。我国地域宽广、人口众多，是世界灵芝生产和消费的主要国家，近年间整个生产和消费稳中有升，发展前景广阔，随着科学技术和人们对灵芝认识的加深，需求量将与日俱增。《中国药典》2000版首次承认灵芝的药用价值，卫生部2001年发布的“可用于保健食品的真菌菌种名单”中，承认了灵芝、紫芝和松衫灵芝。安徽省大别山平均海拔500m，由于地理气候的因素，非常有利于灵芝生长。大别山素有“西山药库”“灵芝之乡”之美誉大别山灵芝是一种无公害，低农残的“绿色食品”。大别山灵芝基地年产灵芝约600吨，灵芝抱子粉约50吨，是目前中国最大的锻木灵芝种植基地，也是国内最大的锻木灵芝及灵芝抱子粉的供应基地。正是由于灵芝具有广泛的药理活性，其疗效已为人们所接受，使得以灵芝为原料的产品种类多，市场大，仅在中国大陆、台湾、日本及韩国就产生了数百万美元的效益，尤其是以灵芝酸和灵芝多糖为开发对象的产品在国外受到人们的关注和欢迎。据日本药局方记载的各种灵芝制剂有片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、干燥浓缩剂、糖衣剂等内服固体制剂配剂、酒精剂等内服液体制剂涂抹剂等外用液体制剂硬膏剂、软膏剂等外用制剂，以上制剂已经制剂化生产。另外，可能制剂化的灵芝制剂有吸入剂、注射剂、眼药水等。国内外开发的部分灵芝酸产品有肝功能促进剂、降血压制品、降胆固醇制品、降血糖制剂、慢性支气管炎治疗剂等。1.2灵芝的营养价值灵芝含有多种氨基酸，蛋白质，生物碱、香豆精、甾类、三萜类、挥发油、甘露醇、树脂及糖类、维生素B2、维生素C、内酯和酶类。硬脂酸、延胡索酸、苯甲酸等为其所含酸内的主要成分[]硬孔灵芝的化学成分研究。可养心安神，寂肺益气，滋肝健脾。主治虚劳体弱，神疲乏力，心悸失眠，头目昏晕，久咳气喘，食少纳呆。灵芝含有极丰富的稀有元素“锗”，能使人体血液吸收氧的能力增加1.5倍，因此可以促进新陈代谢并有延缓老化的作用，还有增强皮肤本身修护功能的功效，可用于各种慢性病所致的面色黄萎及由于气血不足而致的面部光泽等症。灵芝中的多糖具有双向调节机体免疫力，抗肿瘤和护肝的作用；灵芝所含有机锗可诱导人体产生并激活NK细胞和巨噬细胞活性，参与免疫调节；灵芝中的生物碱可以抗炎镇痛；灵芝可以理气化淤、安气益神；灵芝孢子粉能止血、排毒、抗氧化。1.3灵芝的保健及药用价值1.3.1保肝作用王明宇等[59」从赤芝子实体中得到粗灵芝三菇GT，经进一步纯化得GT和GT2主要含灵芝酸A和赤芝酸A。实验表明GT和GT}对四氯化碳、氨基半乳糖普和卡介苗+脂多糖所致的3种肝损伤模型小鼠有较好的保肝作用，可明显降低模型动物的血清ALT和肝脏TG的含量，并不同程度减轻动物肝损伤。Hirotani等[[25」的结果显示灵芝中的灵芝酸提取物能增强肝功能，加强其解毒作用，能降低由四氯化碳中毒引起的血清中转氨酶水平的上升，促进肝炎小鼠肝的再生，增强小鼠对毛地黄皂等毒物的抵抗力作用，它也能降低甘油三脂的合成。1.3.2抗肿瘤作用Toth等[[60最早报道了灵芝三菇类化合物的抗肿瘤药理活性。作者从赤芝菌丝体中提取得到6个有细胞毒活性的三菇类化合物，体外实验表明能明显抑制小鼠肝肉瘤(HTC)细胞的增殖。Xinliu等[6z]对休眠期饱子、发芽期抱子和破壁抱子的抗肿瘤活性进行了比较，结果显示发芽期抱子和破壁抱子的脂溶性提取物对小鼠肝细胞肿瘤、恶性毒瘤S-180和网状细胞肉瘤有显著的抑制作用，抑制作用达80-90%，受试物表现出剂量依赖性。周昌艳等圆采用体外肿瘤细胞培养增殖抑制试验与体内肿瘤细胞抑制试验，结果显示灵芝酸在体外对肿瘤细胞株SW620，LS180，S180的增殖具有明显的抑制作用，体内抗肿瘤疗效试验显示灵芝酸对Lewis肺癌具有一定的疗效，对荷Lewis肺癌的小鼠IL-2的生成及NK细胞的免疫活性均有一定的促进作用。因此可以认为灵芝酸通过直接细胞毒作用及激活免疫体系实现抑制肿瘤作用。1.3.3抗氧化作用Zhu等[66]从赤芝水煮提取物中得到含有三菇类成分的粗组分，通过观察该粗组分对联苯三酚诱导的红细胞膜氧化以及Fe(II)-抗坏血酸诱导的脂质过氧化反应的影响，受试物表现出剂量依赖性的抗氧化作用。1.3.4消炎抗菌作用李平作等[[67]从灵芝深层发酵菌丝体中分离得到三种灵芝酸，其抗菌活性实验显示三种四环三菇酸具有抑制大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄菌和枯草芽抱杆菌生长的活性。蔺丽等[[68]报道从红芝中分离出溶菌酶及酸性蛋白酶，具有抗菌和消炎作用；从紫芝分离出3种葡聚糖能抑制发炎，但不能抑制狗血小板的花生四烯酸的代谢。灵芝的CH2C12提取物具有极好的抗炎活性和显著抵抗PLA2(可诱发鼠后爪水肿活性)。此外，灵芝三菇的药用价值还有：镇痛作用，抑制组胺释放，抑制胆固醇合成，对血小板凝聚的影响等，而且有越来越多的新活性不断被发现和证实。1.4灵芝的活性成分灵芝含有多种活性成分，如多糖、三萜类化合物、核苷、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽、多种酶类等[10]。现代医学研究发现，灵芝中有效成分主要为灵芝多糖和灵芝三萜[5，10，13-14]。三萜类化合物大多具有苦味，强弱随品种、产地、生产条件而异。作为灵芝类的主要化学成分之一，灵芝三萜类化合物吸引了越来越多研究者的关注。灵芝中三萜类化合物包括灵芝酸，灵芝醇，赤芝酮等，按分子中所含碳原子数分为C24，C27，C30三大类，一般将含有羧基的三萜类物质称为灵芝酸。2.灵芝酸的提取、分离研究进展2.1灵芝酸的提取2.1.1溶剂浸提法三菇类化合物难溶于水，易溶于有机溶剂，一般可用甲醇、乙醇或氯仿等有机溶剂提取。常用的方法大致有两类：一是用甲醇、乙醇或氯仿为溶剂提取，提取物直接进行层析分离，二是用甲醇或乙醇提取，提取物经碱处理分出总酸部分再进行分离。李平作[]对发酵液中灵芝酸和菌丝体中灵芝酸的提取分离进行了研究。发酵液经过滤后，用水饱和正丁醇提取三次，合并正丁醇提取液，然后减压浓缩至干，即得粗灵芝酸。菌丝体加入10倍体积的甲醇，回流提取3h，过滤后残渣继续回用提取，重复5次，合并滤液，浓缩至膏状，即为胞内粗灵芝酸。钟建江等[]对菌丝体中灵芝酸的分离进行了研究，先用乙醇提取菌丝体，再用氯仿萃取，碳酸氢钠除杂质的方法来进行分离。王帮武等[]用乙醇浸体子实体，得黑色浸膏，浸膏复溶于氯仿，用碳酸氢钠萃取，调酸后再以氯仿反萃取。马林等[]用甲醇、95%乙醇、氯仿等3种提取溶剂，分别冷浸2，4，8，16和24h，回流1，2和4h或超声提取15，30和60min。结果表明灵芝子实体以氯仿回流提取1h，提取率最高，且样品中杂质干扰较少，故选用氯仿为提取溶剂。2.1.25%的NaHCO3水溶液结合超声提取灵芝酸是难溶于水的物质，通常只能用有机溶剂作为提取剂，但是有机溶剂多数是有毒的，对操作者不利。由于灵芝酸是弱酸性物质，通过使用碱性溶液可以提高其在水溶液中的溶解度，以便安全地提取出灵芝酸量。5％NaHCO3具有较强的碱性和缓冲能力，并且在用HCl把NaHCO3溶液层调至pH值为3时对氯仿萃取无干扰，所以使用5％NaHCO3作为溶剂是个较好选择。顾剑[40]在比较了不同比例的乙醇作为提取剂发现效果不理想后，对直接使用5%的NaHCO3水溶液结合超声提取作了研究。结果证明，使用5％NaHCO3无超声提取可以获得与50％乙醇冷提时相似的值。用5%的NaHCO3水溶液超声提取，2mol/LHCl调pH至3，氯仿萃取，挥干。在29℃（室温）超声3h，得到粗灵芝酸浓度为2.63±0.13mg/100mg干细胞，是可提最大灵芝酸浓度的97%，大大减少了提取所用时间有超声辅助时，得到的值明显提高，比无超声时提高了18.2％，说明用5％NaHCO3作溶剂时超声提取是最佳的实验条件。同时发现用5％NaHCO3作溶剂在无超声辅助提取时，灵芝酸得率随时间的变化较明显，一天后即可达到超声辅助1.5小时的值，说明该溶剂用于提取是很合适的。2.1.3超临界二氧化碳萃取法使二氧化碳气体在超临界状态下与天然原料接触，有关天然成分就会溶解于超临界二氧化碳流体之中，达到了有效成分与原料的分离。然后通过减压或升温的方法，将超临界流体中萃取的有效成分在分离器中分离出来，即得到高品质的有效成分，这就是超临界二氧化碳萃取的简单过程。超临界二氧化碳有气、液两重性的特点(既有与液体溶剂相当的萃取能力，又有优良的传质效果)，与传统的分离方法相比具有许多独特的优点，尤其适用于提取和精制难挥发性、热敏性的天然物质，在医药、食品、香料等领域受到广泛关注。超临界二氧化碳萃取是唯一能在萃取有效成份同时摈弃其他成份的快速有效方式[]。马礼金等[]研究了超临界流体萃取方法提取红芝子实体中的三菇类化合物的工艺条件，为利用超临界二氧化碳法规模化萃取灵芝有效成分奠定了理论基础。结果显示：55℃、改性剂甲醇体积分数10%、萃取剂二氧化碳密度0.40g/mL(不添加甲醇时为0.80g/mL)、平衡3min、流体流速3.5mL/min是较好的萃取工艺条件。中国科学院已采用超临界二氧化碳法直接从破壁的灵芝抱子中萃取出了灵芝三菇类物质，所制得的灵芝抱子油总三菇类含量大于等于20%。2.2灵芝酸的纯化2.2.1大孔树脂提取法利用大孔树脂吸附分离纯化有效成分是近年来在天然产物分离纯化中广泛采用的技术，具有成本低、效率高、可再生等优点。已有研究报道利用大孔树脂吸附提取分离三菇类化合物。大孔树脂是一种不含交换团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。它所具有的吸附性是由于范德华引力或产生氢键吸附的结果，而筛选性分离则是它的多孔性网状结构所决定的。大孔树脂对有机物选择性较好，不受无机盐类存在的影响。一般非极性树脂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质；极性树脂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，而中极性树脂则对上述两种情况都具有吸附力。菇类化合物主要集中在乙醇或甲醇洗脱液中，菇类配糖体主要集中在50%乙醇或甲醇洗脱液中[]。2.2.2硅胶柱层析法这是目前灵芝酸分离纯化最基本的方法，也是最主要的方法。在分离不同的三萜时所使用的溶剂略有不同，常用的溶剂有CHCl3-MeOH，CHCl3-MeOH-H2O，C6H6-MeOH，C6H6-acetone等，用不同配比分段洗脱得到不同分离物。但是这种分离方法较为繁琐，时间较长，而且所使用的试剂