点样微阵列的制备

1点样微阵列的制备点样微阵列的制备过程包含了一系列简单的移液和点样操作，其中许多变量和因素会影响最终制备的点样微阵列芯片的质量。点样针的选择和安装，点样缓冲液的组成和点样过程的质量控制等是这一过程的关键步骤。研究点样微阵列制备方法的最终目的是尽可能的减小和控制样点间的差异，以获得样点性质均一的微阵列芯片。本节内容主要介绍与微阵列点样有关的设备、试剂和方法，影响接触点样效果的各种变量和因素，以及如何对点样过程进行质量控制以获得高质量的点样微阵列芯片。一、前言微阵列技术的发展进步带动了生物分析领域一场重大的变革。最初在基因组学研究中开始得到应用的DNA微阵列基因表达分析技术，现在已经发展成为以蛋白质、细胞、生物膜和小分子等为材料的多种类型的微阵列。能使用较少量的试样来实现高通量分析这一显著特性，大大地促进了微阵列技术的发展。相应地，能够适应各种不同用途的具体要求而将上述各种材料排列在特定的支持物上的微阵列制备技术也日益发展成熟。一般地，各种微阵列制备技术首先应该对制备阵列所使用材料的稳定性没有负面影响，能够在阵列制备过程中保持其生化特性上的稳定；其次，阵列制备技术在将阵列材料从容器中转移到制备阵列的表面时，要具有高精度的移液特性，以保证阵列上不同样点之间的均匀性和一致性，并尽可能地减小偏差。当前各种微阵列的制备有两种主流方式：一种方式是依赖于携带有阵列材料的点样针与阵列支持物表面接触点样，将材料转移到阵列中；另一种方式则是将阵列材料喷射到阵列支持物表面。前者由于在技术上相对简单，容易实现，目前已经有多种商品化的点样仪可供选择，并且与之配套的点样针也是种类繁多，有着各自独特的优点和缺点，涵盖了广泛的应用背景。后者实际上是源于现在广泛使用的喷墨打印机中所采用的喷印技术，这种技术在工作时不需要喷咀和阵列支持物表面发生接触，并且可以精确地实现极微量液体的定量转移，因而在越来越多的新型微阵列制备设备中得到了广泛的采用。应用微点样针，通过接触点样方法来制备点样微阵列芯片这一技术在概念上看起来很简单，然而通过点样法制备的微阵列芯片的应用对生命科学研究所产生的影响却是巨大而深远的。上世纪九十年代中期，斯坦福大学布朗实验室的Schena等人，将单根分叉型点样针固定在自制的X-Y-Z机械手装置上，在计算机控制下，将cDNA样品从96孔板转移到经过表面修饰的玻璃载玻片上，这一工作开启了高密度DNA微阵列制备的先河。随后，这一技术2受到越来越广泛的关注，许多公司开始致力于研究自动化的点样装置和各种结构的点样针，以便能够以更高密度和更快的速度将纳升，甚至是皮升量级的生物材料转移到用于制作微阵列的支持物表面。在这个过程中，研究和开发人员克服了重重困难，成功地使用实心、中空、和毛细管点样针等，将多种不同类型的生物材料互不干扰地转移到阵列支持物上，排列成高密度的阵列，每个样点的直径一般在几十微米到二、三百微米之间。现在已经有许多商用的、和用户自行定制的点样设备可以用于点样微阵列的制备，在点样制备的DNA微阵列芯片中，用于点样到支持物的DNA材料称作探针，而用于和DNA微阵列芯片杂交的标记样品材料称为靶。固定DNA探针的支持物表面通常是包被了活性化学基团的玻璃载玻片，或者是各种滤膜等。尽管这里讨论的主要是关于如何将cDNA和寡核苷酸探针通过点样固定到支持物表面，所涉及到的影响点样的变量和因素、以及点样的方法和步骤也适用于蛋白质等其他分子和材料的点样。二、接触点样技术接触点样这一概念反映了在点样过程中，点样材料、点样装置和点样支持物三者之间空间上的连续性。点样微阵列制备时，所使用的点样材料是各种核酸、蛋白质或细胞等生物分子，点样装置则是各种类型的点样针，而点样支持物则是用于微阵列制备的、经过表面修饰的载玻片等。它们各自的一些物理和化学特性决定了三者之间的相互作用，并与周围的环境因素如温度、湿度、以及点样装置的运动参数，如点样针运动速度和点样针与支持物的接触时间等，共同决定了每次点样过程转移的生物材料的体积和在支持物上形成的样点的形状。其中比较关键的特性有点样材料的粘度和表面张力、点样阵的制作材料和几何形状、以及点样针和点样支持物的疏水特性。此外，在高密度的微阵列制备中，由于需要反复多次将不同的材料分别点样到微阵列中不同的位置上，因此同一根点样针在每次更换点样材料之前要进行彻底的清洗，以完全除去点样针上残留的现有点样材料，重新加样和开始新一轮点样循环。点样针的清洁也是决定所制备微阵列质量和实验结果可靠性的重要因素，如果每轮点样之间，同一根点样针的清洁不充分，就会将点样针上残留的、上一轮点样时使用的点样材料直接带入到下一轮所点样的新样点中，造成交叉污染，这对随后使用微阵列进行的样品检测而言是毁灭性的打击。接触点样中样点的形成过程点样开始时，首先是点样针浸入装有点样材料的容器进行加样，这里点样针的浸入深度和在点样材料中的停留时间非常重要。如果点样针浸入过深，会携带过多的样品，这样使用实心针点样时形成的样点尺寸过大，而使用分叉点样针点样则会使得最初的数个样点尺寸过3大。不仅如此，粘附在点样针表面的过多点样材料有可能被带入后续的点样过程中，造成交叉污染。在对分叉点样针或者毛细管点样针进行加样操作时，点样针的浸入时间要足以保证用于储存点样材料的狭缝或毛细管结构被样品材料完全充满，并且在开始点样前要进行预点样，以避免最初得到的几个不均匀样点对所制备点样微阵列芯片质量的影响。接触点样的第二个步骤是点样针与支持物表面的接触和将点样材料转移到支持物上，形成样点，如图1中所示。这里有一些关键的参数会影响到点样时转移样品材料的体积，以及形成样点的几何形态。首先，点样针与支持物接触时的力量，或者说速度是关键性的因素之一，尤其是在使用分叉点样针或毛细管点样针的情形下，因此需要对点样仪中机械手装置的Z轴减速过程进行精确控制。一旦点样针与支持物表面发生接触，点样针本身的直径、针尖表面的形貌和支持物的表面特性共同决定了点样针和支持物表面之间缝隙的形状、毛细张力的大小、针尖和支持物之间存在的点样材料的量、被挤出针尖区域以外那部分点样材料的量。通常由于毛细张力的作用，一部分点样材料溶液被保持在针尖和支持物之间，同时还有部分点样材料溶液稍微超出针尖的周长范围以外，这些点样溶液中最终有多少会留在支持物表面的样点中取决于点样针在支持物表面的停留时间、点样针离开支持物表面时在Z方向上的回缩速度、点样材料溶液的粘度和表面张力，以及与支持物表面的接触角。对于接触角很大的情形，点样时留在支持物表面的液体先是随机地回缩，这一过程中仍然残留在点样针下端的液滴被拉细成液体线，并在所伴随的液体蒸发作用下使得针尖和支持物之间的液体线断裂而完全分离。如果此时针尖下方液滴回缩过快，液体线会发生不均匀的断裂，这时飞溅出的液滴会在支持物表面所点样的样点周围留下数个微小的“卫星”样点，并对阵列中正常点样的其他样点产生污染。图1接触点样过程中点样材料的转移和样点形成过程。图中从左到右，依次显示了使用250微米实心针，将点样材料转移到环氧硅烷修饰的支持物表面的过程，转移液体的量大约为2nl。从图中可以看出，点样针上的液体并没有被全部转移到支持物的表面，大约有5％液滴在点样针回缩过程中留在针尖表面。假定在点样过程中，所有环境因素、表面特性和机械参数可以保持一致，那么点样时所4转移点样材料的量主要取决于点样材料的成份和浓度，因此这就要求加样板中点样材料的浓度和加样时的浸入深度保持恒定。点样材料转移到支持物表面以后，最终得到的样点形态主要取决于点样溶液在支持物表面的蒸发速率、接触角和其化学组成。点样支持物的影响接触点样所要求的理想支持物表面应该是平整的、并且具有均一性的包被。目前DNA点样微阵列制备中使用最为广泛的支持物是表面通过硅烷化反应衍生了氨基或醛基的载玻片。玻片的这类硅烷化修饰反应已经是广泛使用的技术，但是如何最终得到大量修饰均一、可重复性好、性能稳定的点样用玻片支持物仍然是一个挑战性的工作。为了提高点样过程中每个样点中所包含的点样材料的量，以增强芯片表面的反应信号；以及提供一个类似于溶液相反应的环境，以利于发生在芯片支持物表面的各种生物分子相互作用过程，如核酸杂交、免疫相互作用和配体与受体分子结合等的进行，最近发展起来的一些技术通过在玻片支持物表面修饰上一层聚丙烯酰胺、聚乙二醇等材料形成的三维凝胶状结构薄膜，并在这种表面上制备点样微阵列芯片。这种三维修饰结构提供了更大的表面积，而且使得刚性的支持物表面也具备了类似尼龙膜的芯吸效应（wickingeffect）。这些改变对支持物表面性质的影响是巨大的，它使得在同样尺寸的样点中可以容纳更多的点样材料。控制软件和数据跟踪软件控制部分是接触点样系统的关键组成部分之一。它们提供了图形化的工作界面，使得用户可以设定、管理、监控、记录和跟踪点样操作过程，并对影响点样过程的关键变量和参数，诸如微阵列芯片上的样点间距、点样针预点样样点数量、机械手Z轴运动控制参数、点样针加样和点样时的停留时间、点样针清洗和干燥的操作顺序等进行调整。更为广泛的软件设定包括了样品跟踪功能模块，使得阵列上的样点位置可以和加样板上板孔内的样品之间建立起对应关系。如果将样品跟踪软件与数据库管理软件进行集成，就可以使得实验者能够迅速设计微阵列实验，并在得到结果以后反过来对微阵列实验的设计和点样过程进行优化。在许多点样仪控制软件中，还集成了质量控制功能模块，使得用户可以实施监控点样的质量，并及时发现点样过程中可能会出现的差错和进行修改。与接触点样技术不同，后面将要介绍的非接触式点样技术，或者更为确切地称为喷样技术，由于不需要喷咀和基底之间直接接触，因此在点样过程中，点样材料、点样装置和点样支持物三者之间在空间上是不连续的。这种不连续性带来的好处是减少了对点样过程的影响因素，因此与接触点样相比，喷样针每次转移材料的量可以控制得更为精确、重复性更好，而且在支持物上形成的样点形态更加均一。然而，由于这种非接触式点样技术中使用的喷样5针在结构上一般较为复杂，要使用到螺线管、或是压电装置等来驱动微量液体的分配和转移，因此非接触式点样装置要比接触点样装置在装置结构上更为复杂，价格也更为昂贵。三、点样设备和操作点样微阵列芯片的制备过程如图2中所示。清洗点样针干燥点样针从加样板吸取点样材料移动到下一个点样基底将探针材料点样到基底当前探针点样到所有基底所有探针点样完成清洗点样针干燥点样针完成点样否是点样针上是否有足够材料是否移动到下一个点样基底否图2微阵列的点样过程。6点样仪中硬件部分主要包括机械手控制装置、点样头、点样台、在更换点样针上的点样材料之前对点样针进行清洗和干燥的装置、环境控制部件以及加样多孔板和点样支持物玻片的加载和固定装置。图3中给出的照片是UCBerkeley的Ngai实验室自制的点样仪。此外，点样仪还必须配备相应的控制和操作软件。图3UCBerkeley的Ngai实验室自制的点样仪。左图是整个点样仪的外观，右图是点样头的局部放大。机械手装置控制整个点样过程通过简单的机械手装置来实现，通常是三轴的笛卡尔坐标系形式。X和Y轴的控制精度要求较低，一般使用长行程的滚珠丝杆或导螺杆作为运动轴。当然，现在许多点样仪中也使用了高速、高精度的直线电机作为运动轴。直线电机比传统的丝杆传动系统要昂贵很多，但是它在速度、加速／减速，和运动精度等方面能提供更多的优点。点样仪的垂直轴或Z轴通常使用高精度的导螺杆作为运动轴，但是对行程的需求相当地小。一般典型的样点尺寸在100到200个微米。在支持物上点样所能获得的样点密度首先取决于样点的直径，同时，点样仪机械手装置的X和Y轴的重复性和定位精度也会影响到点样的密度。点样仪中使用的普通机械手装置精度一般在数十个微米，如果需要制备高密度点样微阵列芯片或者是长时间连续运行点样仪，那么机械手装置的精度要在数个微米，并且具有闭环运动控制，以减小系统误差。同时，机械手装置Z轴的垂直定位、以及速度和加速与减速控制在接触点样中也需要精确控制。点样台在点样仪中，用于点样的玻片等支持物通常是排放在一个大的平台上，有