热点实验CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。应用：1.组蛋白修饰研究2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA损伤与凋亡分析。步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNAPolymeraseII）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，NormalMouseIgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（UpststeCatalog#17-371)1、KitDescription：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A.ProvidedKitComponentsStoreat4℃:ChIPBlockedProteinGAgarose1.5mlChIPDilutionBuffer,Onevialcontaining24mlLowSaltImmuneComplexWashBuffer24mlHighSaltImmuneComplexWashBuffer24mlLiClImmuneComplexWashBuffer24mlTEBuffer24ml0.5MEDTA250ul5MNaCl500ulSDSLysisBuffer10ml1MTris-HCl,pH6.5500ul10XGlycine11ml10XPBS24mlStoreat-20℃:ProteaseInhibitorCocktailII（蛋白酶抑制剂）2×110ulRNaseA600ugofRNaseAin60ulsterilewater.ProteinaseK600ugofProteinaseKin60ul1MNaHCO3600ulAnti-RNAPolymeraseII25ugcloneCTD4H8.NormalratIgGStoreatRoomTemperature:20%SDS242ulof20%SDS.SpinFiltersOnebagcontaining22SpinFilterswithCollectionTubesCollectionTubes22CollectionTubes.BindReagentA25mlofBindReagentA.WashReagentB12.5mlofWashReagentB.ElutionReagentC1.5mlofElutionReagentC.B.抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBPBetaantibody[E299](ab32358,嘉美生物提供)NormalratIgGC.仪器设备微量混匀器Vortexmixer,震摇器Rotatingwheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variablevolume(5-1000ml)pipettes+tips高速离心机Microfuge,Variabletemperaturewaterbath,细胞刮子Cellscraper,Sonicator,1.5Ml离心管Microfugetubes,PCR管PCRtubes,D.引物设计略4、CHIP操作流程A.细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1)准备细胞，150mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1x10-7个；2)准备42ml1XPBS(4.2ml10XPBS+37.8mlwater),放入150mm培养皿以冰块预冷；3)取出SDSLysisBuffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4)ProteaseInhibitorCocktailII恢复至室温。正式步骤：1)于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛，室温孵育10min；2)每个培养皿加入2ml10XGlycine（甘氨酸）混匀，室温放置5min，以中和甲醛反应；3)尽可能吸取培养基，不要损伤细胞（冰上操作）；4)以20ml预冷的1XPBS洗涤培养皿，去掉PBS，重复洗涤1次；5)同时取干净试管加入2ml预冷PBS，每管加5ulProteaseInhibitorCocktailII；6)每培养皿加入2mlPBS，刮取细胞至锥形管；7)4℃离心700rpm，时间5min以沉淀细胞，去掉上清；8)将5ulofProteaseInhibitorCocktailII加入1mlofSDSLysisBuffer；9)以1mlofSDSLysisBuffer重悬细胞；10)分装细胞悬液取容积约300-400ul至微量离心管备用。B.超声处理裂解DNA1)管子置于碎冰上，超声处理以打碎DNA，超声发热会部分降解染色质，注意在冰上操作，普通贴壁细胞约1x10-7个细胞/ml需要10次，每次4-5秒的超声处理；超声仪基本要求：50-100WW功率，1-2mm探头。2)4℃离心12000rpm，时间10min，移除沉淀，留下上清。3)上清转移至干净的微量离心管，每管约50-100ul；C.免疫共沉淀蛋白质/DNA准备稀释液（DilutionBuffer,，含蛋白酶抑制剂）置于冰上备用，按照1块胶计算（9个样本）：900ul稀释液中加入4.5ulProteaseInhibitorCocktailII。注：IP应设置阳性对照(Anti-RNAPolymeraseII)和阴性对照(NormalIgG)，阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致。略D.蛋白/DNA-复合物洗脱预先准备：将1M的NaHCO3恢复至室温，使沉淀溶解。,1)准备ElutionBuffer以备IP管和input对照管使用“见C（5）”，每管按照如下准备200ulelutionbuffer：10ul20%SDS，20ul1MNaHCO3和170ulsterile,distilledwater。2)C（5）input对照管加入200ulElutionBuffer放置于室温备用，步骤E备用；3)C（10）完成后，每管（IP管）加入100ulElutionBuffer，混匀于室温孵育15min；4)3000rpm离心1min以沉淀Pelletagarose，收集上清至新离心管；5)重复4-5步骤，最终收集上清约200ul。E.逆转蛋白/DNA交联（留取目的DNA片段）略F.目的DNA的纯化取出SpinFilter-CollectionTube（自旋过滤器/收集管）和单独的收集管CollectionTube备用；略弃去SpinFilter，收集管CollectionTube里面的洗出液即为纯化的DNA，可以进行下一步实验操作或冻存于-20℃.G.PCRofControls试剂：PCRMasterMix(2x),JiamayBiotechDNAMarkerDL2000,JiamayBiotech0.1%DEPC水、氯仿（分析纯）、异丙醇（分析纯）75%乙醇AGAROSE(琼脂糖)AMRESCO，K49910×DNA上样缓冲液,JiamayBiotech0.5mg/mlEB溶液，实验室常备1×TBE,实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南第二版》仪器：(1)PCR仪,ABI9600(2)电泳仪，北京六一仪器公司，DYCP-31DN型(3)高速离心机，湘仪H1650-W(4)紫外分光光度计，上海江仪仪器有限公司，UV-7502C(751)(5)成像系统，柯达紫外显相系统400W像素3、PCR（25μL体系）CompositionVolume（μL）目的DNA1.0Primersense（10μmol/L）0.5Primeranti-sense（10μmol/L）0.5PCRMasterMix（2x）12.5PCRH2O10.5CompositionofPCRMasterMix(2x):0.05units/ulTaqDNAPolymeraseinreactionbuffer,4mMMgcl2,0.4mMdNTPPCR扩增程序：TemperatureTime95℃5min94℃30s40Cycles57℃30s40Cycles72℃30s40Cycles72℃5min4℃∞4、产物用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl（DNA样本8μl+上样缓冲液2μl）,电压120V,电泳完毕后在溴化乙锭(EB)中染色约15分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。5、凝胶图片与平均光密度值阳性条带以Gelpro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值。第一次：第二次：点样说明及IOD参考值分析：泳道12345678样品Tmub1组A组Tmub1组B组INPUT对照组A组INPUT对照组B组阴性对照组（NormalratIgG）A组阴性对照组（NormalratIgG）B组阳性对照组（RNAPolymeraseII）A组阳性对照组（RNAPolymeraseII）B组检测指标Tmub1GAPDH第一次10965180731231521303003910537790R值0.2800.4780.3150.56400------第二次10661192141195220677003945136984R值0.2700.5200.3030.559注：R值为目的基因参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值嘉美生物是一家主要从事AnnexinV,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。相关文章芯片类检测：Luminex\PLEXMAP\BIOPLEX液相芯片检测实验服务细胞生物学实验：流式分选外包服务免疫学实验：流式CBA多因子检测外包实验分子生物学外包服务：个性化治疗分子检测外包服务热点实验服务：国家自然科学基金等基金的申请外包服务热点实验服务：大陆核心期刊三包服务（实验、撰写、发表）原代细胞培养服务：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务原代细胞培养服务：原代肝细胞定制服务