热点实验PKC蛋白激酶活性检测实验

实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司，V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。2．在4℃，用14,000×g离心裂解液5分钟，保存上清。3．用PKC抽提液预平衡1ml的DEAE纤维素柱，再把第2步中得到的上清过柱。用5ml的PKC抽提液洗柱子，然后用5ml含有200mMNaCl的PKC抽提液洗脱含有PKC的组分。4．用PKC稀释液（PKCdilutionbuffer）将少量蛋白激酶C（PromteinKinaseC）稀释到2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。5．用探头超声波破碎仪超声处理PKCActivatorSolution20-30秒，或直到溶液变温暖。6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml小离心管中混合PepTag®PKC5×Buffer,PepTag®C1Peptide，超声过的PKCActivator5XSolution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。标准PKC检测PepTag®PKCReaction5XBuffer5ulPepTag®C1Peptide(0.4ug/ul)5ulPKCActivator5XSolution,超声处理的5ul短肽保护液（非必须）1ul样品9ul去离子水使终体积为25ulPKC阳性对照检测PepTag®PKCReaction5XBuffer5ulPepTag®C1Peptide(0.4ug/ul)5ulPKCActivator5XSolution,超声处理的5ul短肽保护液（非必须）1ulProteinKinaseC(2.5ug/ml溶于PKCdilutionbuffer）4ul去离子水使终体积为25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag®PKCReaction5XBuffer5ulPepTag®C1Peptide(0.4ug/ul)5ulPKCActivator5XSolution,超声处理的5ul短肽保护液（非必须）1ul去离子水使终体积为25ul7．在0时间点，把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2分钟。然后加入样品或蛋白激酶C在30℃再孵育30分钟。8．把管子放进开水浴或95℃加热块10分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃或-20℃。9．把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul的80％甘油，以确保样品保留在上样孔中（说明书第III.F部分）。10．每孔点样10ul，在0.8%琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。检测结果：说明：后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。注：阳性条带以Gelpro4版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integratedopticaldensity）累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+p-PKC总和为100分配IOD数值）Lanes:Lane1Lane2Lane3Lane4Lane5Lane6LanePCRows(%)(%)(%)(%)(%)(%)(%)PKC77.08275.61688.9866.97577.9374.645100p-PKC22.91824.38411.0233.02522.0725.3550Sum100100100100100100100p-PKC:PKC0.297320.3224710.1238480.4930940.2832030.3396740样本#1#2#3#4#5#6PC实验咨询：[e-mail]嘉美生物是一家主要从事AnnexinV,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。相关文章芯片类检测：Luminex\PLEXMAP\BIOPLEX液相芯片检测实验服务细胞生物学实验：流式分选外包服务免疫学实验：流式CBA多因子检测外包实验分子生物学外包服务：个性化治疗分子检测外包服务热点实验服务：国家自然科学基金等基金的申请外包服务热点实验服务：大陆核心期刊三包服务（实验、撰写、发表）原代细胞培养服务：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务原代细胞培养服务：原代肝细胞定制服务