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【嘉美生物】即日起推出WB,IH,ICC,IF实验服务优惠活动，细则如下：1、嘉美生物提供原装进口抗体。我实验室进行实验服务有若干年的历史，因此我们实验室存有大批的国外原装抗体；意味着实验者不必要花更多的钱去购买国外昂贵（一般都会需要2000元以上）的一抗。2、嘉美生物免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂。3、嘉美生物免费提供WB标本所需要的蛋白保护液。该蛋白保护液可以保护样品在4度下保存半个月而不至于蛋白有损失。4、实验委托者之需要提供样品，即可完成整个实验。WB实验服务案例一抗目的蛋白分子量稀释度公司/货号二抗稀释度GoatRock1antibodyAbout160kD1:500SANTA，SC-6055RabbitAntiGoatIgG/HRP1:40,000GoatRock2antibodyAbout160kD1:500SANTA，SC-1851RabbitAntiGoatIgG/HRP1:40,000MouseGAPDHantibodyabout37kD1:800SANTA,SC-365062GoatAntimouseIgG/HRP1:80,000注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；阳性条带以Gelpro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integratedopticaldensity）累积光密度参考值。Fig1：Lanes:Lane1Lane2Lane3Lane4Lane5Lane6Rows(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)Rock1242.39337.97229.78233.16151.48205.53Rock2233.48219.11238.76191.61151.18203.66GAPDH160.18130.47141.06156.13147.77151.07样本编号253828232624WB操作规程一．设备和试剂1．设备①电泳电源Mini-PROTEAN3ElecreophoresisCell,MiniTeans-BlotModule,andPowerPacBasicPowerSupply(BIO-RAD,Catalog#165-3323)②电泳仪及附件Mini-PROTEAN3ElecreophoresisCell(BIO-RAD,Catalog#165-3301)③电转仪及附件MiniTeans-BlotElecreophoresisTransferCell(BIO-RAD,Catalog#170-3930)④NC膜PIERCE，Catalog#88018⑤滤纸Whatman,3MMCHR2.试剂①凝胶试剂（实验室常备）试剂名称厂家30%丙烯酰胺溶液SIGMATris-BaseSIGMA10%SDSSIGMA10%过硫酸铵SIGMATEMEDSIGMA②TotalproteinExtractionKit，ProMab•美国，Cat.No：SJ-200501RenewableBuffer膜再生液，ProMab•美国，Cat.No：SJ-200512天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™(M-PEK)，MERCK•德国，Cat.No：444810天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBusterTMProteinExactionKit，MERCK•德国，Cat.No：71183-3Bradford蛋白浓度测定试剂盒，嘉美生物•中国，Cat.No：BRAKIT细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat.No：P1001细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat.No：P1003③常用溶液及缓冲液A．5%积层胶所用溶液按总体积2.5ml：ddH2O：1.7ml30%丙烯酰胺溶液：0.42ml1.0mol/LTris(PH=6.8)：0.315ml10%SDS：25ul10%过硫酸铵：25ulTEMED：3ulB．分离胶溶液配方参考表C．电泳缓冲液，1L3gTris-Base、14.4g甘氨酸、1gSDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。D．电泳转移缓冲液,1L3gTris-Base、14.4g甘氨酸、甲醇200ml,加蒸馏水至1L,也可以制成10×的储存液，在湿温下长期保存。E．5×样品缓冲液,10ml0.6ml1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml50%的甘油、2ml10%的SDS、0.5ml2-巯基乙醇、1ml1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。④二抗稀释液用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀释。常用SecondaryAntibody：RabbitAntiGoatIgG/HRP,嘉美生物,SEH0103,(1:10,000~40,000)GoatAntiRabbitIgG/HRP(SCBT,Catalog#sc-2030,1:10,000~40,000)GoatAntiMouseIgG+A+M(H+L)/HRP,ZYMED,#62-64201(1:40,000~100,000)Goatanti-ratIgG-HRP,SANTA,sc-2032(1:5000~1:10000)二．蛋白提取（根据样品及检测要求选取以下适当提取方法）A-1．组织裂解提取总蛋白(采用TotalproteinExtractionKit，ProMab,Cat.No：SJ-200501)1)．用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml总蛋白提取液，匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后，再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。2)．超声3次，每次3s。3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中4)．-20℃冻存。A-2．组织裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™(M-PEK)，MERCK，Cat.No：444810）1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和2保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。2)．以下组织的处理应当尽快转移到4℃无菌器皿中,如结缔组织,脂肪血管等，最理想的组织应当切成2到3mm的碎块，然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。4)．组织碎块在100×g4℃条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。6)．转移适当量的细碎切块(可能冰冻的)到一个预冷的匀浆器。(最好是一个玻璃或石英制品)，向匀浆器中加入10ul蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1萃取组织块。7)．小心地匀浆组织碎块，可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体(例如牛的肝脏需要10下)，尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率，可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞，而非对组织进行支离破碎。8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4℃轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。9)．在16,000xg和4℃15min条件下分离不能溶解的材料。10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟4℃条件下轻柔的摇动。推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。12)．在16,000xg和4℃15min条件下分离不能溶解的材料。13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。A-3．组织裂解分离提取浆/核蛋白(采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBusterTMProteinExactionKit，MERCK，Cat.No：71183-3)1)．使用前浆冷冻的ProteaseInhibitorCoctailSet1溶于100ul灭菌水配成100×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。3)．取约1~20mg适量的冻存组织置于EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。4)．将适量粉末转移至预冷的1.5mlEP管中，加入150ulNucBusterReagent1。5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。6)．4℃，16000g离心5min。7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。8)．在絮状沉淀中加入1ul100×ProteaseInhibitorCoctail1ul100mMDTT75ulNucBusterExactionReagent29)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。10)．4℃，16000g离心5min。11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。B-1．细胞裂解提取总蛋白(采用TotalproteinExtractionKit，ProMab,Cat.No：SJ-200501)1)．细胞收集好，加入1ml总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置10~20minmin后，再吹5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。2)．超声3次，每次3s。3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中。4)．-20℃冻存。B-2．细胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™(M-PEK)，MERCK，Cat.No：444810）1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和2保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。2)．将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。4)．在100×g4℃条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。6)．向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1萃取细胞。7)．小心地吹打细胞，尽可能使细胞看不见。8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4℃轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。9)．在16,000xg和4℃15min条件下分离不能溶解的材料。10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀，并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟4℃条件下轻柔的摇动。推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。12)．在16,000xg和4℃15min条件下分离不能溶解的材料。13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。B-3．细胞裂解分离提取浆/核蛋白(采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBusterTMProteinExactionKit，MERCK，Cat.No：71183-3)1)．使用前浆冷冻的ProteaseInhibitorCoctailSet1溶于100ul灭菌水配成100×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。3)．将细胞