牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较

牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较刘春波——12生工2——20120802224摘要：采用福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法对牛奶中蛋白酶的活力进行测定，通过对测定结果的统计学分析和回收率试验探究3种方法的差异。结果表明：3种方法均能从不同角度反映出牛奶的蛋白酶活力。福林法具有精确度和准确度高、重现性好等优点，虽然操作复杂，但能够更为直接客观的反映出牛奶的蛋白酶活力，适合于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比色法具有较好的精确度和准确度，结果重现性好，反应时间短，但测定过程中由温度引起的十二烷基磺酸钠（SDS）溶解性问题对测定结果影响较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的精确比较；福林法虽然操作简便，但精确度和准确度较差，结果重现性不好，适合于牛奶中蛋白酶活力的粗略性和比较性测定。关键词：牛奶；蛋白酶；福林法；邻苯二甲醛衍生比色法；甲醛法前言：蛋白凝块现象是牛奶储存过程中较为常见的质量问题[1，2]。研究表明，蛋白凝块是由牛奶中的蛋白酶水解乳蛋白生成肽、氨基酸所引起的[3-5]。为了控制蛋白酶引起的质量问题，需要对牛奶中蛋白酶活力进行测定。酱曲、糙米、豆粕等的蛋白酶活力测定已有成熟的方法[6-8]，而牛奶中蛋白酶活力的测定始终没有统一的标准和方法。据文献报道，采用的测定方法有甲醛法[9]、邻苯二甲醛衍生法[10]和福林试剂法[11]，但对于不同测定方法的比较却鲜有报道。本研究选用福林法、邻苯二甲醛衍生法和甲醛法这三种方法对牛奶中蛋白酶活力进行测定，评价选择出更适合牛奶中蛋白酶活力的测定方法，为生产控和产品质量检测提供理论依据。1.1材料与试剂市售UHT利乐砖纯牛奶；福林试剂，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，酪素（化学纯），无水碳酸钠，三氯乙酸，十二烷基磺酸钠（SDS），四硼酸钠（分析纯），邻苯二甲醛（化学纯），-巯基乙醇（分析纯）。1.2仪器与设备TU-1901紫外可见分光光度计，LD4-2A低速离心机，HWS-26电热恒温水浴锅，78HW-1恒温磁力搅拌器，XK96-A快速混匀器，PHS-3CpH计。1.3方法1.3.1福林法测定牛奶中蛋白酶活力参考GB/T23527-2009的方法略作修改[12]。此方法原理是蛋白酶在一定的温度和pH下能够水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸如酪氨酸，在碱性条件下与福林试剂反应，生成钼蓝与钨蓝，通过紫外分光光度计测定，从而计算出蛋白酶的活力[13]。分别取不同质量浓度的酪氨酸标准溶液（0，10，20，30，40，50mg/L）各1mL，加入浓度为0.4mol/L的碳酸钠溶液5mL，福林试剂溶液1mL，显色反应在（40±0.2）℃中持续20min。将反应液取出后，在680nm下测定其吸光度。根据酪氨酸不同浓度对应的吸光度值绘制标准曲线。取1mL待测牛奶样品，加入10g/L的酪素溶液1mL，在（40±0.2）℃下反应10min，取出静置后过滤。再取滤液1mL，与5mL的碳酸钠溶液、1mL的福林试剂混合后，在（40±0.2）℃下显色20min，于680nm下测定其吸光度。空白组测定方法相同，只是在加入酪素之前先加入三氯乙酸使蛋白酶失活。牛奶中蛋白酶活力为X=AK×4/10，式中：X为牛奶样品的蛋白酶活力（u/mL）；A为牛奶样品的吸光度；K为吸光常数（即根据回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量）；4为反应试剂的总体积；10为反应时间。1.3.2邻苯二甲醛衍生比色法测定牛奶中蛋白酶活力参考Church[14]和张艳[10]的方法略作修改。此方法的原理是邻苯二甲醛衍生试剂在碱性介质中与游离氨基酸反应生成异吲哚衍生物，在340nm下有特征吸收，通过测定吸光度计算出牛奶中游离氨基氮的浓度，以此反映出蛋白酶的活力。将40mg的邻苯二甲醛溶于1mL甲醇中，分别加入25mL浓度为100mmol/L的四硼酸钠、2.5mL10%的SDS、100L的-巯基乙醇，加水定容至50mL，即为邻苯二甲醛衍生试剂（OPA）。分别取不同浓度的苯丙氨酸标准溶液（0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4mmol/L）各150μL，加入3mL的OPA试剂，室温下反应2min，340nm下测定其吸光度值。根据苯丙氨酸不同浓度对应的吸光度绘制标准曲线。取10mL待测的牛奶样品在4000r/min下离心分离20min，以脱去脂肪。取脱脂后的牛奶样品2.5mL，分别加入5mL质量分数为12%的三氯乙酸、0.5mL蒸馏水，在2000r/min下离心15min。取清液150μL，加入3mL的OPA试剂，室温下反应2min，340nm下测定其吸光度值。根据苯丙氨酸标准曲线计算出牛奶中游离氨态氮的浓度。1.3.3甲醛法测定牛奶中蛋白酶活力采用康小红[9]的方法并进行修改。此方法是通过测定牛奶中氨基酸态氮的质量浓度来反映蛋白酶的活力。其原理是利用了氨基酸的两性作用，甲醛能够固定氨基的碱性，使氨基酸的羧基显示出酸性，通过氢氧化钠标准溶液滴定来定量，以酸度计测定滴定终点。具体方法：取60mL待测的牛奶样品于200mL锥形瓶中，开动磁力搅拌器，用浓度为0.05mol/L的氢氧化钠标准溶液进行滴定，至pH值为8.2时记下消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，此数据可反映出牛奶中的总酸质量浓度。加入10mL甲醛溶液后，再用浓度为0.05mol/L的氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH值为9.2，记下此时消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，以此计算出牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度。以水为空白对照。牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度按以下公式计算：X=[(V1-V2)×c×0.014]/V3×100，式中：X为牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度；V1为牛奶中加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；V2为空白组加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；V3为牛奶样品的取用量；c为氢氧化钠标准溶液的浓度。2.43种测定方法的比较从测定原理来看，福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法这3种测定蛋白酶活力的方法都是以测定产物氨基酸的量来表示蛋白酶活力。但是，福林法是对蛋白酶分解酪素产生的含有酚基的氨基酸进行测定，以酪氨酸的量来表示牛奶中氨基酸的量，邻苯二甲醛比色法是通过对与邻苯二甲醛衍生试剂反应的游离氨基酸进行测定，以苯丙氨酸的量来表示牛奶中氨基酸的量，甲醛法则是通过消耗碱液的量来测定氨基酸态氮的质量浓度，以氨基酸态氮的质量浓度来表示牛奶中氨基酸的量。3种测定方法和表达方式有所不同，但福林法从原理上能够更为实际地反映出牛奶中蛋白酶的活力。从检测过程来看，福林法反应条件苛刻，试剂大多需要现配现用，操作复杂；邻苯二甲醛衍生比色法反应时间最短，操作较甲醛法稍显复杂，测定过程中温度对SDS溶解性影响较大，SDS的溶解性对吸光度又有直接影响，因而在测定中对温度的控制增加了操作的复杂性；甲醛法是3种方法中操作最为简便的，反应时间适中。从测定结果来看，福林法精确度和准确度高，3次重复实验中结果重现性好；邻苯二甲醛衍生比色法精确度和准确度也高，3次重复试验中结果重现性较福林法较差，这可能是由于测定中环境的温度变化引起吸光度的差异；甲醛法精确度和准确度均较低，3次重复试验中结果重现性较差。将3种方法测定的结果进行比较分析，其所测得牛奶中蛋白酶活力的表达方式不同，福林法得到的酶活力单位为u/mL，邻苯二甲醛法得到的酶活力是以每升牛奶中游离氨基氮的毫摩数来表示，而甲醛法测得的酶活力是以100mL牛奶中氨基酸态氮的克数来表示，很难直接进行数值比较。因此，对牛奶样品进行稀释，分别用3种方法测定稀释后牛奶的蛋白酶活力，结果如表10所示。运用统计学的相关分析（t检验：成对双样品均值分析）对三组数据进行处理，福林法和邻苯二甲醛衍生比色法测定结果的相关系数为0.986，福林法和甲醛法测定结果的相关系数为0.956，邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法测定结果的相关系数为0.983，表明3种方法的变化趋势是一样的，都可以从不同角度反映出牛奶中蛋白酶的活力，结果之间可以进行比较客观的比较。3结论试验对福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法这3种测定牛奶中蛋白酶活力的方法进行比较，从相关性结果来看，3种方法均能从不同角度反映出牛奶中蛋白酶活力。福林法虽然操作复杂，但其测定结果能够直接客观的反应出牛奶中蛋白酶活力，精确度、准确度和灵敏度高，重复实验结果的重现性好，适合于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比色法测定的蛋白酶活力是以1L牛奶中游离氨态氮的毫摩数来表示，精确度和准确度好，灵敏度高，反应时间短，但测定过程中由温度引起的SDS溶解性问题对测定结果影响较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的精确比较；甲醛法是以100mL牛奶中氨基酸态氮的质量来表征蛋白酶活力的，操作简单，但是准确性和精确度都较低，重复实验时结果的重现性不好，适合于粗略性和比较性测定。参考文献：[1]生庆海，张爱霞.UHT乳贮存，问题及其原因分析[J].中国乳品工业，2002(5)：14.[2]闫志国.UHT乳生产工艺及其在贮藏期间理化性质的变化[J].乳业科学与技术，2011(3)：114-117.[3]于维军，王瑞强，赵庆江.超高温灭菌乳的主要质量问题及控制措施[J].中国乳品工业，2006，34(6)：55-57.[4]付文菊.嗜冷菌及其耐热性酶对乳制品品质的影响[J].农产品加工，2009(9)：78-80.[5]王辉，吕加平，刘鹭.耐热蛋白酶对UHT乳蛋白的水解作用[J].食品科学，2010，31(17)：228-231.[6]李存富.酱曲蛋白酶活力测定-氨基氮法[J].中国调味品，2006(3)：4849.[7]鲁红侠，杜先锋，陈文帮，等.糙米发芽过程中蛋白酶活力动态变化研究[J].食品工业科技，2013，34(10)：272-276.[8]吴辉，卓林霞，解检清，等.发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响[J].现代食品科技，2008，24(10)：973-976.[9]康小红，孙国庆，付治军，等.UHT牛奶蛋白凝块产生原因及控制措施的研究[J].食品工业科技，2008，29(5)：165-167．[10]张艳，郭利春，郭奇慧，等.UHT乳结块原因分析[J].食品研究与开发，2007，28(12)：84-86.[11]袁玮，胡海蓉，赵怀根，等.鲜牛乳中乳杆菌的检测及脂肪酶、蛋白酶测定方法的研究[J].食品与发酵工业，2000，27(6)：35-38.[12]中国国家标准化委员会.GB/T23527—2009中国标准书号[S].北京：中国标准出版社，2009.[13]郑玉才.加热和磁处理对牛奶中酶活力及蛋白组成的影响[J].中国乳品工业，1994，22(4)：171-172.[14]CHURCHFC，SWAISGOODHE，PorterDH，etal.Spectrophotometricassayusingo-phthaldialdehydefordeterminationproteolysisinmilkandisolatedmilkproteins[J].DairySci.，1983，66(6)：1219-1227.