特殊组织DNA的提取及鉴定

特殊组织DNA的提取及鉴定1、提取DNA的简易方法:1)、从全血中提取DNA：取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的ddH2O混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，（若沉淀中仍有红细胞,需重复此操作1-2次）加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进行扩增。2)、从其它有核细胞中提取DNA：可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。2、从全血中用有机溶剂提取DNA：1）试剂a.10%SDSb.2.0M醋酸钠c.20mg/ml蛋白酶Kd.苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)e.分析纯乙醇f.TE(10mMTris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5)2）步骤A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中，样品用手倒转试管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料离心管中，-70℃储存。B、在解冻的（或液体的）血液中加入800μl的TE并混匀，12000rpm离心2分钟。C、吸取1.0ml上清液并弃去。D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。E、向沉淀中加入：375μl2M醋酸钠;25μl10%SDS;5μl蛋白酶K溶液。略加振荡，于56℃保温一小时。F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇，振荡30秒。G、12000rpm离心5分钟。H、小心移出水相（上层）到一新的1.5ml的离心管中。I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇，倒转试管加以混合，将试管于-20℃下放置10分钟以上。J、12000rpm离心10分钟。K、倾去酒精，用移液器小心吸去剩余酒精，不要触动沉淀。L、加180μlTE后振荡。加20μl2M醋酸盐，手工混匀。M、加500μl预冷分析纯酒精，用手轻轻混匀，12000rpm离心10分钟，倾去上清液。N、用室温下的70%酒精1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟，倾去上清液。O、用移液器吸去残余的酒精，管子置于真空离心抽除残余的酒精（大约10分钟）。或将管子放在100℃以下烘干。P、加200μlTE于DNA沉淀中，混匀后于4℃保温过夜（或56℃溶解DNA2小时以上），次日清晨振荡10秒。3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA1)试剂a.斑痕抽提缓冲液（1.21gTris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇，2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0）b.其它试剂见2.1)2)步骤A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶K溶液，混匀，离心数秒使碎片浸入液体。C、于56℃保温过夜。D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇，手摇混匀，12000rpm离心3钟。F、将上清液转移到新的离心管。G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。H、手摇混匀试管中的各种成分，放置-20℃10分钟以上。I、12000rpm离心10分钟。J、倾去酒精。K、用1ml室温的70%酒精洗涤。L、12000rpm离心5分钟。M、倾去酒精，用移液器吸去残余酒精。N、真空离心10分钟除去残余酒精，或在100℃以下烘干.O、56℃下用36μlTE溶解DNA，时间至少2小时。4、从精斑中分离提取DNA1）试剂a.TNE缓冲液（1.21gTris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升）b.20%sarcosylc.0.39M二硫苏糖醇d.其它试剂见2.1)2)步骤A、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5ml塑料离心管中。B、管中加入400μlTNE缓冲液；25μl20%sarcosyl;75μl水；5μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37保温2小时。C、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后从管中取出，再用12000rpm离心5分钟。D、移上清液（内含裂解细胞或雌性片段）于一新的1.5ml管，不要振荡沉淀物（内含非裂解细胞或精子）。再用TNE洗脱沉淀物四次。E、在有沉淀的管中加入10μlTNE;50μl20%sacrosyl;40μlDTT;150μl水；10μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37℃保温2小时。F、按3，2）E～O的方法分别抽提出两管中的雌性DNA和精子DNA。5、用Chelex从全血/血斑中抽提DNA1）试剂a.TEb.5%Chelex100(w/v于无菌水中)2）步骤A、3μl全血或3mm×3mm的血斑置于灭菌的1.5ml离心管中，加入灭菌的1mlTE于管中，振荡数秒。B、置于室温30分钟，振荡数秒。C、用12000rpm离心3分钟。D、弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀。E、加入200μl5%Chelex，振荡数秒。F、于56℃保温30分钟。G、振荡数秒。H、沸水浴8分钟。I、振荡数秒。J、用12000rpm离心5分钟，上清中为提取的DNA。6、用Chelex从精斑中抽提DNA1）试剂a.TEb.10mg/ml蛋白酶Kc.20%Chelex100（w/v于无菌水中）d.洗脱缓冲液(10mMTris,10mMEDTA,50mMNaCl,2%SDS,Ph7.5)e.1M二硫苏糖醇2）步骤A、将附有检材的棉签或纤维置于1.5ml灭菌离心管中，加1ml灭菌的TE，振荡数秒。B、室温30分钟。C、振荡数秒。D、用一新的灭菌牙签将残片拧干后从管中取出。E、用12000rpm离心3分钟。F、弃去上清液，但保留约50μl上清液，勿使细胞沉淀搅起（若沉淀体积较大，应保留更多上清液，在此例中，保留的上清液体积应为沉淀的2倍）。G、加150μl灭菌的蒸馏去离子水和2μl蛋白酶K溶液。H、56℃保温1小时以裂解非精子细胞。I、用12000rpm离心5分钟，沉淀为精子沉淀。J、取150μl上清液（含裂解细胞组分）及到一新的1.5ml离心管中，再加50μl20%Chelex，振荡数秒后，稍加离心，然后接步骤O～S进行操作。K、用0.5ml洗脱缓冲液重新悬浮原管中的沉淀，略加振荡,用12000rpm离心5分钟，弃去约450μl上清液。L、重复步骤K再洗四次。M、用1ml灭菌的蒸馏去离子水重新悬浮沉淀，稍经振荡，用12000rpm离心5分钟，弃去950μl上清液。N、加150μl的5%Chelex，2μl蛋白酶K溶液，7μl1M的二硫苏糖醇于精子组分，振荡数后，稍加离心。O、56℃保温1小时。P、振荡各管数秒。Q、样品于沸水浴8分钟。R、振荡数秒。S、用12000rpm离心3分钟，两管的上清中分别含有非精子细胞DNA和精子细胞DNA。四、PCR扩增:取一支离心管，加（反应管数+1）×（2μl10×引物混合物+2μl10×反应混合物+0.4μlHS-Taq（用前必须用手弹匀），混匀后，每个反应管分装4.4μl，然后,加提取的DNA2μl,再加13.6μlddH2O和一滴石蜡油,（若模板DNA浓度太低,可适当增加其体积,但同时要减少ddH2O体积,以保持总反应体积为20μl）稍离心后按下列条件进行扩增：95℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒；63～56℃退火30秒（每循环一次降低一度）；72℃延伸1分钟，共循环30次。最后72℃保温10分钟。