猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒说明书

猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒说明书PseudorabiesVirusgpIAntibodyTestKit(PRVgpI-Ab)用途畜得测PRVgpI是用于检测猪血清中伪狂犬病病毒（PRV）gpI抗体的酶联免疫检测试剂盒。gpI(又名gE)抗体的存在表明猪曾感染PRV的野毒株和/或接种过含gpI抗原的疫苗。在美国，该试剂用于猪场管理和猪伪狂犬病的根除计划。当猪场使用gpI缺失PRV疫苗（如BoehringerIngelheim公司，Norden公司，Syntrovet公司和Solvay公司产品），并由批准实验室检测时，该试剂被用作州/联邦猪伪狂犬病消除计划的正式判定实验。概述用来保护猪免受伪狂犬病感染的传统策略，包括使用普通PRV疫苗和USDA许可的基因缺失PRV疫苗。传统的血清学方法检测免疫后PRV的感染情况有很大的局限性，因为它们不能区分免疫猪和自然感染猪。国际上许多疫苗生产商研制了安全有效的PRVgpI缺失疫苗，这种疫苗的使用可以使血清学方法区分免疫猪和自然感染猪。在这些疫苗中使用的病毒经过选择后消除了毒力因子的合成，但并不影响病毒的抗原性。另外，由于编码非必需蛋白质gpI的DNA序列的自然缺失，从而提供了血清学的鉴别机制。因此畜得测PRVgpI检测试剂盒能够排除gpI缺失PRV疫苗免疫抗体的干扰，从而能特异性地检测出野毒株感染的动物和含有gpI抗原的PRV疫苗免疫的动物。试剂盒中使用的抗体是gpI特异性单克隆抗体。使用gpI缺失疫苗免疫前，应使用该试剂盒或畜得测PRV筛选和/或确认试剂盒来确定猪的免疫状态。猪经过免疫后，应至少每半年使用PRVgpI试剂常规检测一次猪PRV野毒株的感染情况。原理畜得测PRVgpI试验使用两倍稀释(1:2)的血清在PRV抗原包被的微孔中进行。在第一次的孵育阶段，存在于血清中的包括抗gpI抗体在内的PRV抗体，与塑料板孔上的抗原反应。洗涤后，酶标抗PRVgpI单克隆抗体加到微孔板中，并在第二次孵育中竞争结合gpI病毒抗原。如果被检血清中没有gpI抗体，酶标gpI抗体可与gpI抗原自由反应。相反，如果被检血清中存在gpI抗体，则酶标gpI单克隆抗体与抗原的反应被阻断。孵育后，没有反应的标记物被洗去，加入底物/显色剂溶液后，在酶的存在下，底物转变为一种能与显色剂反应产生蓝色的物质。使用分光光度计测量650nm的吸收值A(650)。被检样品的A(650)值除以阴性对照的平均A(650)值，计算得出样品/阴性值（S/N）。样品中gpI抗体的含量与其A(650)和S/N值成反比。如果存在抗gpI抗体，表明以前曾感染PRV野毒株或应用过普通的弱毒疫苗或灭活疫苗。使用畜得测PRV筛选和/或确认试验检测到PRV抗体，而畜得测PRVgpI试验检测不到gpI抗体的存在，表明猪免疫过gpI缺失疫苗。试剂1．PRV包被板6块30块2．HRPO标记抗PRVgpI抗体：含蛋白稳定剂的缓冲液，庆大霉素防腐60ml350ml3．阴性对照：对PRVgpI无反应的猪血清，叠氮钠防腐5ml5ml4．PRVgpI阳性对照：抗PRVgpI抗体，叠氮钠防腐5ml5ml5．样品稀释液：蛋白稳定缓冲液，叠氮钠防腐120ml300mlG．10倍浓缩洗涤液：磷酸缓冲液，庆大霉素防腐235ml1440mlH．TMB底物液60ml315mlI．终止液60ml315ml自备器材1.50、100μl精确微量移液器或连续移液器。2.一次性移液器吸头。3.配制洗涤液的500ml量筒。4.96孔板酶标仪。5.稀释样品的玻璃或塑料管。6.蒸馏水或去离子水。7.滴加和吸去洗涤液的装置。8.吸液用的真空和控制装置。使用注意事项1.处理所有的PRV材料以免PRV的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV的传染源。2.勿用口移液。3.使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。4.TMB底物和终止液对皮肤有刺激性。5.试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRVgpI抗体的污染。6.TMB不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB底物液。7.所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。8.所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。9.注意防止试剂盒成分的污染。10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。样品的制备用样品稀释液将被检样品稀释2倍(1:2)。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV包被板前应混匀。洗涤液的制备浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10倍稀释（例如：每块板用30ml浓缩液加上270ml水）。操作步骤使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。2.在A1，A2和A3孔内加入100μl两倍稀释(1:2)的阴性对照。3.在A4，A5孔内加入100μl两倍稀释(1:2)的阳性对照。4.在其余的孔内分别加入100μl已稀释好的被检样品。5.室温下孵育1小时或2－7℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。6.用大约300μl洗涤液洗涤板孔，重复3－5次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。7.每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记抗PRVgpI抗体。8.室温下孵育20分钟。9.重复步骤6。10.每孔加入100μlTMB底物液。11.室温下孵育15分钟。12.每孔加入50μl终止液，使反应终止。13.分光光度计调零。14.测量并且记录被检样品和对照的A(650)。15.计算结果。结果阴性对照A(650)的平均值减去阳性对照A(650)的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果试验无效，试验操作可能有误，试验应重做，并应详细阅读说明书。首先通过计算每个样品的S/N值，判定其gpI抗体的有无。具体方法参见样品结果的计算。注意：北京爱德士元亨生物科技有限公司有进行平均值和S/N值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统（xChek）。结果判定1.如果S/N值低于或等于0.60，样品应判定为PRVgpI抗体阳性。2.如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间隔一定时间后重新采样、检测。3.如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRVgpI抗体阴性。注意：确定阳性应作两次重复。