猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。1.PCV-2国内外最新流行动态由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。山东农科院畜牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实PCV-2防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为34.66%（124/357），2011年检出率为25.59%(174/588)；2012年检出率为21.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。2.PCV-2病毒特点基因组内存在11个潜在ORFs，即ORF1-ORF11，其中ORF1、5、7、10方向相同,为顺时针方向；ORF2、3、4、6、8、9、11方向相同，为逆时针方向PCV-2全长由1768或者1767个核苷酸组成，目前出现了新的1766个核苷酸的病例[9]。PCV2基因型内核苷酸序列非常保守，同源核苷酸的同源性大于96%。3．PCV-2(圆环病毒)毒株流行情况根据对PCV-2毒株的序列分析结果，将PCV-2病毒分离株分为5个亚型(PCV-2a～PCV-2e),鉴于PCV-2a和PCV-2e都有l768bp的基因组；因此，又把这几个基因型统称为PCV-2a，所以PCV-2a基因型包括PCV-2a、PCV-2e等型；而PCV-2b、PCV-2c和PCV-2d都有l767bp的基因组，因此，又把这几个基因型统称为PCV-2b，所以，PCV-2b基因型包括PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d等型。随着时间推移，PCV-2基因型也有所变异，通过检测分析，世界范围内主要流行PCV-2亚型已从PCV-2a转化为PCV-2b(Patterson等，2010)，即PCV-2b为主要流行亚型，毒力也最强。Li等(2010)对2001-2009年间报道的136株PCV-2中国株进行了分析，结果表明PCV-2b占127株，PCV-2a占9株，其中2001年中国流行株以PCV-2a为主，以后PCV-2b占绝大部分。2010年，西北农林科技大学张彦明[10]也得出类似结论：其对1999年～2009年NCBI中登录的556个PCV-2分离株全基因序列进行分析。结果表明，1999年～2002年所登录的PCV-2的优势流行毒株为基因a型(PCV-2a)；从2003年开始基因b型(PCV-2b)逐渐为优势流行毒株，在PCV-2分离株中基因b型所占比例，2004年为95.4％，2007年～2009年均超过76.0％。2003年～2009年国内的PCV-2分离株有287个，其中250个为PCV-2b，37个为PCV-2a，表明PCV-2b是国内猪群中的主要优势毒株。通过建立PCV-2a和PCV2-bPCR检测方法，对70份临床病料的检测显示，PCV-2检出率为34．29％(24／70)，基因型均为PCV-2b，无PCV-2a的检出，表明PCV-2b为检测猪群中的主要优势毒株。4.疫苗研究进展目前国内外学者对PCV-2疫苗的研究主要是从灭活疫苗、构建嵌合病毒、亚单位疫苗、重组腺病毒基因工程疫苗以及核酸疫苗等方面进行研究。现在取得新兽药证书的有20家，其中包括外企4家，但在中国注册仅有1家，为勃林格，国内企业有文号的有10家，马上上市的也有10家。合法上市的17家圆环疫苗，不包括通过其它渠道进入中国市场的梅里亚、英特威/先灵葆雅、富道/硕腾3家及易邦的中试产品。这21家圆环病毒疫苗产品表现以下特点：按生产方式可分：基因工程疫苗和全病毒灭活疫苗4.1基因工程疫苗：又可分为基因工程亚单位疫苗和基因嵌合疫苗由于圆环病毒毒力弱，全病毒培养获得高滴度病毒难度大，部分企业采用原核表达和真核表达的方式，通过蛋白纯化浓缩提高抗原水平。勃林格、英特威/先灵葆雅为昆虫杆状病毒表达的基因工程亚单位疫苗，用PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的PCV-2Cap蛋白，制备亚单位疫苗。而易邦采用PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2Cap蛋白，制备亚单位疫苗，但是原核表达易出现包涵体，包涵体没有活性，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果，这个也是为什么国外企业采用真核表达的原因。从工艺上讲，勃林格、英特威/先灵葆雅属于哺乳动物细胞真核表达，而易邦属于原核表达，真核表达对工艺要求是远大于原核表达系统，这和国外企业相比还是有一定差距的。富道/硕腾为PCV1-PCV2嵌合疫苗，把PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）替换PCV-1的ORF2基因（Cap蛋白），灭活制备基因嵌合体疫苗。4.2全病毒灭活疫苗4.2.1生产工艺由于原核表达与真核表达成本高，而且表达产量有限，对于蛋白纯化要求较高，制约了产品的市场推广。所以更多的是采用全病毒灭活的方式研究疫苗，梅里亚是最早投放市场的全病毒灭活疫苗，但梅里亚圆环疫苗没有在中国注册。关于全病毒灭活疫苗最大的瓶颈在于如何获得高滴度病毒液，所以必须优化工艺，提高滴度，目前，生物制品厂家多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒（通过悬浮培养GMP验证的车间很少），这就能克服圆环病毒毒力弱带来活力不强的难题。4.2.2毒株目前市场上主要还是全病毒灭活疫苗，主要毒株：SH株、LG株、DBN-SX07株、WH株、ZJ/c株之分，但从本质上讲，是没有区别的，因为圆环病毒具有致病性的只有圆环2型，而且只有1个血清型，这5个毒株均属于PCV-2b，毒株只能表明分离地点以及天然免疫原性而已，笔者在NCBI上下载了PCV-1、PCV-2a、PCV-2b等参考序列，运用MEGA4．0进行与疫苗毒株ZJ/C株、WH株、LG株、SH株、DBN-SX07株等序列进行比对，我们清晰的发现：ZJ/C株、WH株处于同一分支；LG株、SH株处于同一分支；DBN-SX07株与LG株、SH株遗传距离更近，这个也与毒株分离早晚有一定关系，LG株、SH株疫苗2011年上市、DBN-SX07株疫苗2012年上市、ZJ/C株、WH株2013年上市，但这5个毒株均处于1个大分支，这也说明他们之间的遗传距离比较近，所以，对于圆环病毒这个产品来讲，依据毒株选择疫苗没有多少实际意义，市场宣传毒株只是炒作的噱头而已，关键还是要病毒含量的高度。4.2.3病毒含量关于病毒含量，养殖场（户）老板以及技术人员一般对于此项技术参数理解较差，因为病毒含量的表示通常比较抽象，但此项技术指标也是最重要的参数，因此，这里提示各位养殖同仁注意。疫苗的免疫效果与病毒含量成正比，提高疫苗效果最好的方式之一就是增加抗原滴度。目前市场上的疫苗上市时间早晚不一，毒株各异，病毒含量差别也比较大，早期上市的产品病毒含量比较低，但最近上市的无论ZJ/c还是WH株，病毒含量都达到107.0TCID50以上，病毒含量最高的产品甚至是最低产品的63倍。对比各个毒株：病毒含量ZJ/c株＞WH株＞SH株＞LG株=DBN-SX07株。用另一种直观表示方式：ZJ/c株1头份=2头份WH株=20头份SH株=63头份LG株/DBN-SX07株。猪圆环病毒含量比较表4.2.4佐剂目前猪圆环病毒疫苗所用佐剂主要有水包油（O/W）、油包水（W/O）、水包油包水(W/O/W)3种剂型，水包油（O/W）佐剂：又称为水质佐剂，和水的吸收性差不多，特点是比较稀。油包水（W/O）：又称为油类佐剂，特点缓释作用比较强。水包油包水(W/O/W)：又称为双相佐剂，特点介于水包油（O/W）、油包水（W/O）之间。猪圆环病毒疫苗佐剂比较但目前生物制品厂家基本都宣传自家的好，由于圆环病毒毒力较弱，免疫原性较差，而且病毒很难获得高滴度培养，所以在佐剂的选择就显得非常重要，无论是哪种佐剂，都具备增大抗原颗粒，提高免疫原性，缓释作用，持续刺激，延长保护期的作用。所以佐剂的选择也必须考虑到吸收性与缓释性的平衡，所以这个只是厂家宣传显示与众不同的着眼点而已。作为养殖户选择疫苗注意观察两个指标：通针性与保护期，这个两个指标就是针对佐剂吸收好、缓释强的最好诠释。4.2.5灭活剂猪圆环病毒是公认的免疫抑制的重要病原，尽管毒力相对较弱，但风险很高，目前基本都是灭活疫苗。灭活疫苗就牵扯到灭活剂的问题，使用灭活剂就要考虑有无残留的问题，如果存在残留，就会出现易致癌性、过敏反应几率高、疫苗反应重等缺点。目前的灭活剂主要有：甲醛、BEI(二乙烯亚胺)、BPL（β-丙酰内酯）三种，甲醛最大优势价格便宜，灭活彻底，缺点是易造成残留，而且灭活会损伤病毒的糖蛋白，造成免疫原性下降，BEI和BPL，不易残留，不损伤糖蛋白，不影响免疫原性，但存在不易保存、价格昂贵的缺点。目前，灭活剂的发展趋势就是使用无残留的方法发展，国外大部分产品基本转上BEI、BPL灭活剂。但综合这几种灭活剂，BPL是灭活时间最短的（2个小时就可以彻底灭活），灭活最彻底得，不易残留（37℃，2个小时彻底水解），目前，也是最炙手可热的灭活剂。猪圆环病毒灭活剂比较4.1.2.6首免日龄目前首免日龄主要有2周龄、3周龄、4周龄，还有免疫母猪等首免方式，由于圆环病毒最大的危害主要表现在保育猪上，也就是说需要早免疫，对于圆环的防控有很大的帮助，所以有很多企业，说明写着3周，却建议2周龄免的这种现象的出现，就是出于这个原因。4.2.6首免日龄与免疫次数目前首免日龄主要有2周龄、3周龄、4周龄，还有免疫母猪等首免方式，由于圆环病毒最大的危害主要表现在保育猪上，也就是说早免疫，对于圆环的防控有很大的帮助。首免日龄越早，但猪日龄越小，免疫器官免疫功能低下