猪圆环病毒病临床诊治与病理组织学观察

猪圆环病毒病临床诊治与病理组织学观察袁志平1，陈如圣2，罗军荣1*（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045；2.江西农业大学兽医院江西南昌330045）江西南昌某猪场今年4月份感染猪圆环病毒病，主要临床表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征，造成较大经济损失，为了对断奶仔猪多系统衰弱综合征病理组织学进行研究，本文通过临床诊断、病理剖检变化及PCR实验室诊断技术确诊了该猪场存在猪圆环病毒2型感染。取病死猪肝、肾、淋巴结、肺等组织制作石蜡切片，HE染色，于显微镜下进行临床病理组织学观察，发现淋巴结生发中心淋巴细胞空泡化坏死，少量淋巴小结坏死。肾脏有白斑，间质性肾炎，淋巴细胞浸润。肺有间质性肺炎，支气管周边间质增宽，肺气肿等特征，以上病理特征对该病具有诊断及治疗价值。关键词：猪圆环病毒病；仔猪断奶后多系统衰竭综合征；PCR；病理组织学观察断奶仔猪多系统衰弱综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS）是由猪圆环病毒2型（PorcineCircovirus-2，PCV-2）引起的猪的一种新的传染病[1]。猪圆环病毒2型被认为是PMWS的主要病原[2]。病毒粒子直径14－17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在pH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1为非致病性的病毒，PCV-2为致病性的病毒。PCV-2主要侵害机体的免疫系统，单核细胞和巨噬细胞是PCV-2的靶细胞，可以造成机体的免疫抑制[3]。猪圆环病毒主要通过猪的鼻液、粪便、呼吸道、公猪精液等传播，仔猪可被感染PCV-2的母猪感染，受感染的母猪会表现出返情率增加、流产、产木乃伊胎，并可垂直传播。本病每个季节都可发生，发病率和死亡率不一，当呈地方性流行时，发病率和死亡率均低，但急收稿日期：2014年12月11日项目基金：江西省教育厅科技计划项目：GJJ11397；江西农业大学自然科学基金09003308作者简介：袁志平：从事动物疾病临床研究。*通讯作者：E-mail：[e-mail]性大爆发时，发病率可达到50%，病死率达到20%～30%。猪对PCV-2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。目前PCV-2免疫密度虽普遍较高，但免疫效果合格率并不理想。在一些小型的养殖场往往只注重继发或并发疾病的治疗而忽视猪圆环病毒的基础防控，盲目进行药物治疗，结果给养殖户带来更大损失。1材料试验动物：来源于某猪场断奶6周龄左右的疑似自然感染PCV-2断奶仔猪病例，取肝、肾、淋巴结、肺等病变组织器官，病变具有代表性。2方法2.1样品采集与固定：对收集到的病猪进行临床观察和病理剖检，记录病理变化；取肺、肾等组织脏器，立刻进行PCR检测；取淋巴结、肺、肾脏、小肠、心脏、脾、胃等组织器官，用10%中性福尔马林固定24小时以上，以供切片制作。2.2PCR诊断2.2.1引物引物设计参考相关文献[4-5]，并根据GenBank发表的猪圆环病毒2型基因序列，利用DNAstar软件设计1对引物，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，上游引物P1：5’-TCTAGATCTAGCGATGACGTATCC-3’，下游引物：P2：5’-TTTCAGCTGTCACTTAGGGTTAAGTGG-3’。2.2.2病毒DNA提取取30~50mg组织和组织裂解液1000μL匀浆后，放入保温箱半小时，加入600μL苯酚，4℃12000rmp离心5min；再取上清和氯仿异戊醇（24:1）600μL，4℃12000rmp离心5min；然后取上清和400μL无水乙醇，4℃12000rmp离心5min；接着弃去上清液，吹干，最后加入30μL无菌双蒸水。2.2.3PCR反应体系3μL组织总DNA提取液，3μL8mmol/LMgCl2，2.5μL10mmol/LdNTP，10μL10×PCR缓冲液，上游引物P1和下游引物P2各2μL，0.5μL(2.5U/μL)TaqDNA聚合酶，用无菌水加至总体积为100μL。PCR程序为：94℃热变性5min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，同时设置阴性对照。3结果与分析3.1PCR检测结果对病死猪脏器组织经PCR扩增和10g/L琼脂糖凝胶电泳后，可观察到约为730bp的特异性核苷酸条带（图1），与预期的片段大小相符，PCV-2检测阳性。图1病料组织PCR扩增产物M.DNAMarker;1-3.PCR扩增产物;4.阴性对照3.2临床剖检结果病猪全身淋巴结肿大4~5倍，特别是腹股沟淋巴结（图2-1）、肠系膜淋巴结、支气管淋巴结肿胀明显，有少许出血点，切面硬度增大，可见均匀的白色。脾轻微肿大，无光泽。肺脏被膜增厚，间质增宽，缺乏弹性，质地变硬，其上散在有大小不等的褐色实变区，肺尖叶发生实变（图2-2）。肾脏肿大，土黄色，表面有散在的白色斑点（图2-3）。肝脏轻度萎缩。其余组织和器官未见明显的眼观病变。3.3病理组织学观察主要病理组织学病变化在淋巴结、肺脏、肾脏、肝脏。3.3.1淋巴器官和淋巴结可见淋巴细胞减少，少量淋巴细胞坏死，生发中心细胞空泡化坏死（图2-4），轻微肉芽肿性淋巴结炎，有多核细胞和巨噬细胞浸润，胞浆内有圆形病毒包涵体，均质两性染色。3.3.2肺观察到支气管和肺泡周边间质增宽，出现大量淋巴细胞、少量浆细胞浸润（图2-5）。不同病例表现为轻度多灶性或高度的弥漫性间质性肺炎，部分肺的血管有淋巴细胞、组织细胞浸润，偶尔出现多核巨细胞。3.3.3肾肾髓质部间质增宽、淋巴细胞浸润，轻度或严重多灶性间质性肾炎（图2-6），肾皮质部间质有淋巴细胞、组织细胞浸润，少数病例出现肾盂肾炎、急性渗出性肾小球肾炎。3.3.4肝存在不同程度淋巴细胞浸润，肝细胞发生颗粒变性（肝细胞胞浆内可见嗜伊红颗粒）。3.3.5其他组织病理变化：肠绒毛萎缩性变化；心肌萎缩，颗粒变性出血；脾脏质脆，淋巴细胞坏死流失，留下少量脾小体；胃固有层淋巴细胞浸润。图2病理剖检及病理组织学变化1.腹股沟淋巴结肿大，2.肺间质增宽，3.肾土黄色，有白斑，4.淋巴细胞生发中心细胞空泡化坏死（HE×100），5.肺泡周边间质增宽，有大量淋巴细胞（HE×400），6.间质性肾炎（HE×100）4讨论发病猪为6周龄断奶小猪，根据发病小猪临床表现、剖检变化以及肝、肾、淋巴结、肺等器官病理组织学变化及核酸检测，从而确诊为由PCV-2感染引起的仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）。发病猪已经接受过猪圆环病毒的免疫，却仍然发病，说明猪圆环病毒的免疫方法或程序不正确或者免疫不确实。这提示猪场内应实行封闭式生产，严格控制外来人员和外来车辆进入猪场，执行各项相关的防疫制度，做好猪圆环病毒等免疫工作，提高猪群整体的免疫水平。123456从临床解剖和组织病理两方面来看：发病猪全身淋巴结肿大4~5倍，淋巴细胞数量下降，淋巴组织中巨噬细胞浸润，外周血和淋巴组织中的巨噬细胞、单核细胞数量升高，表明PCV-2严重侵害猪的免疫系统，从而导致感染猪体况下降，免疫功能低下，使猪群对其他病原的抵抗力显著降低。因而，发病后应加强饲养管理，做好环境卫生工作，饲料中适当添加中草药、抗氧化剂、硒、维生素E等免疫增强剂，提高猪群免疫力。参考文献:[1]叶文贵.一起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的诊治体会[J].畜禽业.2007，(02)[2]张桂云，邓同炜.猪圆环病毒与仔猪多系统衰竭综合征[J].河南畜牧兽医，2003，(02)[3]刘金鑫，孙孟娇，陈磊，王雪娇，银森森.猪圆环病毒研究进展[J].动物医学进展，2012，02:94-97.[4]芦银华，华修国，陈德胜，黄伟坚，戴亚斌，谈国蕾,陈溥言.猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析.病毒学报，2003年19卷第01期.[5]王忠田，杨汉春，郭鑫.规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查.中国兽医杂志，2002年第10期.备注信息作者：袁志平，男，出生于1989年，2014年应届研究生，研一。通信地址：江西省南昌市昌北经济经济开发区江西农业大学6栋315邮编：330045联系电话：[phone]电子邮箱：[e-mail]图2—2图片为下图，它可以再WPS软件中显示出来，在Word显示不出来。我这边一直没法把图片放上去，麻烦您帮我放上去。