猪瘟病毒研究进展

猪瘟病毒研究进展摘要：猪瘟（CSF）是一种高度接触传染性致死性疾病，对家猪和野猪都有危害。猪瘟的爆发能够对养猪业造成重大的经济损失。防控和净化该病的主要策略是通过系统的疫苗免疫和免疫稳定后的不免疫净化策略。对于该病防控及净化措施的探索使得学术界和养猪界取得了长足的进步，并且通过不间断的探索，我们对CSFV的复制机制、毒力有了明确的认识，并有助于我们研发相应的疫苗。该综述中，我们对最近在CSFV流行病学、基因组分子结构与特征、病毒毒力的分子机制及抗病毒技术的发展等方面的最新研究成果进行综述。关键词：CSFV、流行病学、反向遗传学、猪瘟病毒生存期、蛋白质功能、病毒毒力1猪瘟的流行特点和免疫策略猪瘟（CSF、HC）是一种高度接触传染性致死性疾病，对养猪业造成了重大经济损失。该病被OIE陆生动物卫生法典列为必须通报的疾病。该病最早于1810年在美国田纳西州被发现，随后迅速传播至世界各地。该病在加拿大（1963）、美国（1978）、澳大利亚和新西兰等国已被成功净化，但是仍肆虐在亚洲国家、南美、东欧以及部分前苏联国家。该病的病原是猪瘟病毒（CSFV），属于黄病毒科瘟病毒属成员，与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）及边界病毒同属一科。控制CSFV的策略主要包括两个方面，即扑灭措施（不免疫）和系统的免疫净化措施。在采用不免疫策略时，猪瘟疫情的爆发会给高密度养猪区域带来重大经济损失。因此，在除了欧盟之外的许多国家都是用系统的免疫和免疫后净化策略来控制CSFV。例如，中国当前采取的即是免疫净化策略，国家规定养猪区域每年的免疫密度必须达到90%以上。自1904年该病的病原被定性为病毒以后，许多CSFV疫苗被研发。改良活疫苗（通过在非易感宿主体内连续传代得到的减毒活疫苗）被大量使用，其中最主要的毒株是商品化的C株疫苗，该毒株相对其他毒株而言具有安全高效的特点。C株疫苗能够上调抗体水平，并且能够活化T细胞的免疫应答，而基于E2蛋白的亚单位疫苗仅仅能够诱导一种抗CSFV的抗体产生。通过对CSFV毒株的进化分析得知，该病毒分为三种基因型，其中又分为高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力或无毒力毒株（大多数疫苗株）。高毒力毒株和改良的或疫苗毒株都属于基因1型，而基因2型和3型毒株具有较低的毒力。如我们之前报道的一样，基因1型CSFV在田间能够发生多种突变，发生在欧洲和亚洲的基因2型CSFV疫情越来越多。这种现象表明来源于基因1型毒株的E2亚单位疫苗可能不能对基因2型毒株的高毒力CSFV产生有效的保护作用。C株疫苗在很长一段时间内应该都是有效的，得益于它能够诱导T淋巴细胞免疫。GPE毒株疫苗在猪体内传代后毒力有返强现象。C株疫苗的毒力不能通过连续的猪与猪之间的传播试验而返强，但是该毒株能够与田间流行毒株发生基因重组，从而产生新的特性未知的毒株。基于以上的研究结果，对DIVA标记的基因2型疫苗的研制显得特别重要，这有助于我们对CSFV进行控制和净化。该产品的实现依赖于对反向遗传系统的操作和对CSFV蛋白功能的了解。2反向遗传系统和CSFV毒力研究2.1反向遗传系统反向遗传学（RG）能够建立一种有着全长病毒基因拷贝的病毒，该方法是现代病毒学研究中一种强有力的手段。RG在探究病毒的复制、感染、病毒蛋白的功能、重组的发生率、病毒与宿主的相互作用、抗病毒研究及标记疫苗研究等方面发挥重要作用。截至目前，已有至少五种拯救CSFV病毒的方法，这些方法从很大程度上促进了CSFV研究的进程。1996年的一项极具重要性的研究报道了一种体外转录系统，研究发现，SK6细胞系在被转染了体外转录得到的RNA后拯救得到了感染性的CSFV。然而，体外转录的RNA的含量很低，随后，四种更好的反向遗传系统被构建，一是Fan等于2009年报道的BHK-21细胞的转染效率是PK15细胞的10倍之多，他们创建了一种新的程序，使用高效转染的细胞（BHK-21）转染体外合成的RNA，利用PK15IX细胞评价BHK-21细胞（没有CSFV受体）和PK15细胞（有CSFV受体）的转染效率，结果发现，将被感染的PK15细胞的上清作用后，相比于只用体外转录的RNA转染PK15细胞，能够提高8倍的效率。二是VanGennip等于1999年研究出的一种新奇的、更加方便高效的体内转录系统，该系统与体外转录系统相比能提高200倍左右的病毒量，他们建立了一种稳定的能表达T7RNA聚合酶（SK6-T7RNApol）的猪肾细胞系，并且将一种线性化的质粒DNA转染进了SK6-T7RNApol中。三是BergeronandPerreault于2002年插入了丁型肝炎病毒核糖酶以发挥其催化形成准确的3′非编码区的作用。病毒的3′非编码区在一种重要的叫做SrfI的酶的帮助下能够规避模板DNA的线性化（Zouetal.,2011）。为了避免线性化，VanGennip等于1999年利用SK6-T7RNA-pol与环状DNA一起进行体内转录，该操作与体内转录相比提高了20倍的病毒滴度，但是与线性DNA的体内转录相比，病毒滴度降低了近10倍。Huang等2013年使PK-15细胞系稳定表达T7RNA聚合酶（PK15-T7RNApol），而后利用它进行体内转录。四是Li等于2013年构建的CSFV的一个5′非编码区被CMV启动子、T7启动子和锤头状核酶（HamRZ）标记、3′非编码区被HdvRZ、T7终止子和SV40标记的cDNA克隆。HamRZ在被设计的CSFV中能够形成一个精确的5′非编码区，并且该cDNA克隆能够被T7RNA聚合酶或者RNA聚合酶2系统（CMV启动子）所拯救，由CMV启动子在体内转录生成的病毒的量是由T7启动子在体外转录量的120倍左右。一些派生出的cDNA克隆被建立以便进行CSFV的调查研究。重组的能够稳定表达氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因的CSFV病毒能被当做一种对病毒复制和基因表达情况进行定量分析的有效工具。基于这些改变，Qiu的实验室研究出了三种相似的重组cDNAs：一是EGFP-CSFVcDNA，它是由CSFVN蛋白的13和14个氨基酸之间插入EGFP基因后生成的用于一种简单的血清中和试验。然而，对于EGFP的检测需要大量的、昂贵的自动化图像处理设备，并且不能与高效筛选试验（HTS）进行有效的结合。为了解决这一问题，一株能够稳定表达荧光素酶（Fluc）的CSFVN-Fluc病毒被研制，该病毒中荧光素酶基因被插入到N蛋白基因中以便于进行快速和定量筛选，并能评价CSFV抗病毒药物的效果。另外，一种N蛋白N末端有半胱氨酸短肽标签（TC）（CCPGCC）的cDNA被构建，用于对N蛋白进出核进行可视化的检测。这些可视化的修饰能被用作标记疫苗的候选物，并且有助于我们更进一步地研究CSFV。迄今为止许多具有重大意义的发现都是基于反向遗传系统的，这些发现对于研究CSFV的毒力机制和蛋白的功能建立了较好的基础。这些结果有助于我们开发有效的标记疫苗，尽管CSFV的基因组在发生着突变、重组和其他的一些变化。2.2CSFV毒力的分子机制我们可以轻易地通过在与病毒的侵入、释放、复制速度、与宿主蛋白相互作用及其他的一些必要的生理过程有关的保守区引进突变获得改变了毒力的CSFV。迄今为止，通过我们对CSFV的cDNA进行反向遗传修饰，发现有7种蛋白（Npro,Core,Erns,E1,E2,P7,NS4B）与病毒的毒力有关。对N蛋白的敲除能够降低病毒的毒力，并且能够诱导SPF猪的免疫反应，该结果提示我们N蛋白在一定程度上与病毒的毒力有关。核心蛋白的四个保守区域（I,II,III和IV）能够与IQGAP蛋白（Rac1和Cdc42的效应器）相互作用，核心蛋白I和III保守区的插入能够与宿主细胞蛋白IQGAP1相互作用，导致病毒毒力的完全丧失。核心蛋白中的氨基酸替换如K11A,K12A和K53A能够扰乱核心蛋白与SUMO-1之间的相互作用，另外，K220A这一替换能够阻止核心蛋白和UBC9之间的联系。所有的这些替换都能够降低CSFV的毒力。另一种致弱CSFV的方法是在Erns蛋白中插入N2A/Q以破坏其糖基化位点，这表明糖基化反应与病毒的毒力有关。迄今为止，所有被分析的瘟病毒属成员包括四个分子内二硫键，它们是由Erns中八个保守的半胱氨酸残基组成。内部的二硫键是由第九个半胱氨酸残基（171Cys）组成，该二硫键能够稳定Erns的二聚体结构并且能够影响病毒的毒力。当Erns蛋白中的30His和79His（79AA定位在RnaseT2家族的保守区）被删除后也能够降低CSFV的毒力，原因是降低了Rnase的活性。高致病性毒株Brescia的E1蛋白C末端被插入19个氨基酸后其毒力能够完全被消除，表明C末端对病毒的毒力维持至关重要。特别地，高毒力毒株BICv在E1蛋白中的N6A、N19A和N100A发生替换后，毒株的繁殖能力和毒力都能被降低。当Brescia毒株的E2蛋白被替换后也能降低该毒株的毒力，表明E2蛋白是CSFV毒力的主要决定蛋白。CSFVE2蛋白中A区域的保守表位140-TAVSPTTLR-148对病毒的毒力起着重要作用。E2基因有一个O-连接的糖基化位点和留个N连接的糖基化位点，所有的这些糖基化位点都与病毒毒力有关，并且对猪体产生保护性抗体和亚单位疫苗的研制具有重要作用。E2蛋白中710位Leu向His的突变只有伴随着Erns蛋白的一些突变如276R,476R,477I才能够减弱病毒的毒力。对E2蛋白C末端多个氨基酸的替换也能够影响CSFV的毒力。P7能够影响CSFV的毒力、复制和感染型病毒的组装。NS4B蛋白中有一个假定的Toll/白介素-1受体样区域，该区域中有两个保守盒子区域（盒子1：195IYKTYLSIRR204；盒子2：228SVGIAVML235），这些保守区域的突变也能够影响CSFV的毒力。基于这些研究发现，我们推测针对CSFV保守区进行的修饰或改变能够导致该病毒毒力的变化。然而，CSFV的毒力可能还与别的蛋白有关，如Npro,C,Erns,E2,P7和NS4B。3CSFV病毒复制周期和基因组分子结构3.1病毒复制周期近几年在CSFV复制周期方面有了大量的研究和结论，当然还有很多环节是不清楚的。一旦CSFV到达宿主体内的靶细胞后，就通过E1和E2糖蛋白介导的粘附和侵入过程开始其感染周期，但是细胞表面受体至今尚未被研究透彻，但是CSFV的受体有可能是CD46，它是BVDV的受体。另外，CSFV的内吞机制也尚未明了（BVDV的侵入依赖于网格蛋白介导的内吞作用）。病毒侵入后，即开始由依赖pH的糖蛋白介导的膜融合，该过程由酸化作用起始，另外，E2蛋白中的短肽129CPIGWTGVIEC139也可能参与了膜融合过程。病毒囊膜与细胞膜融合后，病毒核衣壳被释放到被侵染细胞的细胞质中，此时不依赖于帽子结构的翻译过程导致多聚蛋白的产生并且病毒基因组的复制被启动。CSFV的复制需要负链RNA的合成，它在合成后代RNA的过程中起着模板的作用，研究发现NS5B蛋白能够更有效地与负链RNA的3′非编码区结合而不是正链RNA的3′非编码区。NS2-3与辅因子NS4A一起介导病毒粒子的形态发生。最终，感染性粒子成熟以后，病毒体从宿主细胞中被释放。所有成熟的蛋白（除了N蛋白）和辅因子N2-3对于猪瘟病毒的复制周期来说是必要的，而NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B对于CSFVRNA的复制来说是必需的。细胞被感染后，细胞内的许多生物过程被调控以加强病毒的复制并在一定程度上介导免疫逃避。这些过程被核蛋白的类泛素化途径调节，在actin和E2蛋白之间相互作用，NS2作用导致S期阻滞，NS5A刺激自噬，N蛋白和Erns调控先天性免疫力。3.2CSFV基因组和蛋白的结构特征Erns蛋白是一个高度糖基化蛋白质，分子质量的50%大都由碳水化合物构成。Erns以二硫键形成同源二聚体，分子质量大约为97ku，并且以两种形式存在于宿主细胞中，一种是病毒蛋白，另一种是分泌蛋白。Erns蛋白不仅是一种结构蛋白，而且也是一种多功能性蛋白。它具有神经毒性，抗蠕虫活性以及转