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实验二猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见CuZn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。二、试剂与器材1、试剂：ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/LpH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA钠盐溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等。2、器材：752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。三、操作步骤1.SOD提取取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为0.15：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心10min，收集红血球。然后用2倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液0.5mL。过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度），上清液加热到65℃-70℃，保温15min，然后迅速冷却到室温，4000r/min离心5min，弃去沉淀物，收集上清液（样品2记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。粗酶液中加入等量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，冰箱中静置1h，然后4000r/min离心10min，弃去滤液得沉淀。讲沉淀用丙酮洗两次，离心收集沉淀，自然干燥得绿色成品，称重。按1mg/1mL溶于蒸馏水，备用。2、SOD酶活性测定(1)邻苯三酚自氧化速率的测定。取两支试管加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的吸光值变化在0.07左右。(2)酶活力测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。(3)酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按照下列公式计算酶活性：单位活性(u/ml)=50%100%×/AoAm-Ao）（×反应液总体积数×样液体积样液稀释倍数其中Ao为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后的邻苯三酚自氧率总活性（U）=单位活性×酶原液总体积(4)蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝G-250法）A标准曲线制作盖上塞子，摇匀。在595nm下闭塞测定光密度值，1h内完成。试剂试管123456蛋白标准液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）10.80.60.40.20考马斯亮蓝（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100以牛血清蛋白（ug）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。B样品中蛋白质含量测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取一支具塞试管，加入0.1mL样品提取液，加入0.9mL蒸馏水和5mL考马斯亮蓝试剂，其余操作同上。C蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量，计算其浓度。（5）结果处理利用考马斯亮蓝法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。计算公式为：比活力（U/mg）=每毫升酶液活性单位（U/ml）/每毫升酶液蛋白浓度（mg/ml）将测得的数据或计算结果填入下表提纯步骤酶液总体积（mL）蛋白质（mg/mL）酶活性U/mL总活性U比活性U/mg回收率%纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀四、实验结果1、[1]邻苯三酚自氧化速率=（0.092+0.078+0.086+0.079）/4=0.083/min。分别计算加入样品1后邻苯三酚自氧化率：0.054/min0.062/min0.059/min0.065/min0.060/min所以，加入样品1后邻苯三酚自氧化率为：0.3/5=0.060/min分别计算加入样品2后邻苯三酚自氧化率：0.051/min0.043/min0.041/min0.043/min0.0445/min所以，加入样品2后邻苯三酚自氧化率为：0.2225/5=0.0445/min分别计算加入样品3后邻苯三酚自氧化率：0.057/min0.063/min0.054/min0.049/min0.046/min所以，加入样品3后邻苯三酚自氧化率为：0.269/5=0.0538/min酶活力计算参照表提纯步骤样液体积ulAm反应液总体积ml酶液总体积ml除血蛋白上清1000.06001014.5热变性后上清1000.0445108.5丙酮沉淀上清1000.0538103根据公式计算得3个样品的单位活性依次为：55.41（U/ml）、92.77（U/ml）、70.36（U/ml）；总活性依次为：803.45（U)、788.55（U)、211.08（U)。2、蛋白质含量测定结果标准蛋白的含量与吸光度值记录表实验测得三个样品的蛋白质吸光值分别为：0.306、0.033、0.099，根据标准曲线y=0.0033+0.0054计算得出蛋白质的含量依次为：1.001mg、0.084mg、0.284mg。3、结果汇总提纯步骤酶液总体积（mL）蛋白质（mg/mL）酶活性U/mL总活性U比活性U/mg回收率%纯化倍数除血蛋白上清141.00155.41803.4555.351001热变性后上清8.50.08492.77788.551104.4098.119.95丙酮沉淀30.28470.36211.08247.7526.34.48蛋白质ug020406080100吸光值00.0490.1530.2440.2480.321五、讨论1、从蛋白质标准曲线图的R²=0.9607来看，实验结果并不准确，未达到0.999但可以作为本实验的参考，也可以用来计算蛋白质的含量，然而通过计算得到的蛋白质含量、酶活性及比活力等数据，就可能不是太为准确，造成这样情况的原因可能是与实验当时酶量称量不准确和操作过程不规范有关。2、由实验结果汇总表可以看出，热变性后上清液中的蛋白质含量迅速降低，但酶活和比活性却猛增，尤其是比活性，这俨然不符合正常规律，说明在第二步样品处理过程中出现了部分失误。另外经过三步提纯以后，理论上应该是蛋白质含量越来越高，酶活性和比活力都是更高，但丙酮沉淀后的酶液、酶活及比活力都较样品2降低了很多，猜测这是操作过程中引起S0D酶的活性丧失了部分和操作误差的原因。