环境工程技术

研究生专业课程论文题目：环境工程技术姓名：学院：资源与环境科学学院专业：环境工程班级：学号：指导教师：职称：教授2015年1月4日南京农业大学教务处制１基因芯片在环境保护中的应用作者王汉宇指导老师蔡天明摘要：基因芯片技术是21世纪生物技术的重要发展，是生命科学与物理学、化学、微电子学以及计算机学等学科相互交叉的一门高新技术。该技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化、自动化，基因芯片技术应用于功能基因研究、杂交测序、药物筛选诊断、基因表达、基因多态性和突变检测等，除了在生物学、医学、制药学、司法和农林业等领域上都有极为广阔的应用外，在环境保护上，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。关键词：基因芯片；环境保护；环境污染；微生物检测GeneChipTechnologyanditsApplicationinEnvironmentProtectionAuthorInstructorAbstract：Genechiptechnologyisoneoftheimportantdevelopmentofbiotechnologyinthe21stcentury,anditisahightechnologywhichthelifescientificandphysics,chemistry,microelectronicsandcomputerscienceandotherdisciplinesintersectat.Thesalientfeaturesofthistechnologyisitshighdegreeofparallelism,diversification,miniaturization,automation,Genechiptechnologyhasbeenusedinfunctionalgenomicsresearch,hybridizationsequencing,drugscreening,diagnosis,geneexpression,genepolymorphismandmutationdetection,etc.Apartfromtheexternalapplicationonthefieldofbiology,medicine,pharmaceutics,judicialandagroforestry,Inenvironmentalprotection,Ontheonehanditcanquicklydetectthepollutionandharmcomesfrommicroorganismsororganiccompoundsofenvironment,human,animalandplant.Butalsotoseekprotectionthroughlarge-scalegeneticscreening,andpreparegeneticengineeringdrugstohazardPreventionorgeneproductwhichcancontrolpollution.Keywords:GeneChip；environmentprotection；environmentpollution；microbialdetection前言基因芯片,又称DNA微探针阵列(microarray),是一种最重要的生物芯片的一条分支，是伴随人类基因组计划而产生的，该技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化、自动化，被认为是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性的技术突破。是近年来不仅在分子生物学及医学诊断技术的重要进展。它的工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的,都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交,通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子识别探针,能够一次分析大量的基因,进行大信息量的筛选与检测。基因芯片可以快速有效地检测污染源，检测由微生物、有机物等引起的污染，对环境污染物进行检测与评价。同时能够帮助研究人员通过大规模的筛选制备能够治理污染源的基因产品或寻找到保护基因并制备防止危害的基因工程产品。２1基因芯片的原理和种类1.1基因芯片的产生1985年,美国科学家率先提出人类基因组计划，由此揭开人类生命科学史上的伟大工程，随着人类基因组计划实施，大量的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据以前所未有的速度增加，怎样去面对如此众多的基因并探讨其在生命活动中担负的功能就成了生命科学者们共同的任务。有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片，以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查,直到1994年,由于光电化学的进展、光刻技术的诞生,Pease等人创造的光导原位合成(Light--direetedsymothesis)高密、微化的寡核昔酸阵列(ODTA)技术得以问世，这才使设想逐步成为现实。基因芯片采用微加工和微电子技术，可在大小1cm的固相表面组装固定若干、几十、成千甚至上万个不同DNA探针，以形成生物分子高密、二维阵列的微型生物化学分析系统，能够实现对基因分子信息个别及大规模的分析和检测。1.2原理基因芯片的原理是基于核酸分子碱基之间(A一T/G一C)互补配对的原理，利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术将一系表面构成微点阵，然后将标一记的样品分子与微点阵上的DNA杂交,以实现对多到数万个分子之间的杂交反应,并根据杂交模式构建目标DNA的序列，从而达到高通量大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因(DNA)分子是否存在的目的。例如将由A、T、C、G4种核普酸任意组合形成的八聚体寡核昔酸探针(65536个)和1个长度为12个寡核昔酸碱基组成为AGCCTAGCTGAA的DNA单链进行杂交反应,结果有5种探针可以和目标DNA互补结合，它们分别是TCGGATCG、CGGATCGA、GGATCGAC、GATCGACT和ATCGACTT。将这些具有重叠序列的探针进行重排就可以构建目标DNA的互补序列。1.3种类基因芯片的类型较为繁多，其分类方法较多：根据载体基质不同分为:无机片基基因芯片，指其基质基片是无机物，如:玻璃、硅片等，有机片基基因芯片，指其基质基片是有机物，如:凝胶、尼龙膜等；依据探针合成的顺序分为:原位合成基因芯片和预先合成后上样的基因芯片，前者通过聚乙二醇或硅烷类化学试剂在不同位点合成不同的探针，后者比较简单，先制备好cDNA或寡核营酸，然后在经特殊处理的玻片、硅片或膜上点样；按照基因芯片的用途可分为:基因表达芯片和DNA测序芯片，前者可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源不同的个体(正常人或患者)、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、不同的病变、不同刺激(包括不同诱导和不同治疗手段)下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，对这些基因表达的个体特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断，将某个或某几个基因与疾病联系起来，极快地确定这些基因的功能，且可进一步研究基因与基因间相互作用关系，后者则是对大量的基因进行序列分析。按基因芯片组装的探针可分为:寡核昔酸和cDNA芯片，前者可用于基因组学及表达谱研究，后者仅用于表达谱研究。2基因芯片技术2.1DNA阵列的构建和印制根据芯片种类的应用目的的不同，芯片核酸阵列的构建方式也不相同，首先是根据研３究目的选用合适的寡核苷酸、cDNA片段或特定的功能基因等，按统计方式事先构建成点阵列，然后，将所需用的核酸片段就位合成于芯片上，或以大致相当的浓度，变性后采用手工或机械的方法，按一定的排列方式点样在特定的固相支持物上，前者称为原位合成，后者可有压电打印和直接点样两种方法。2.2靶样品的准备靶样品就是DNA样品，主要来源是从生物细胞中提取mRNA后经转录成cDNA通常采用常规的基因分离、反转录、扩增的标记等，为了获得杂交信号，在扩增过中加同位素或化学荧光进行标记。同位素常用P33/S35，使用荧光标记，没有同位素的放射危险性，通过激光共聚焦扫描仪器寻址测读，具有很高的分辨能力、极高的灵敏度和定位功能，是目前广泛用于芯片杂交结果判读的标记方法，荧光标记染料已开发出了数10种。2.3杂交和检测杂交：芯片杂交过程与传统的Southern印迹杂交等类似，属于固－液相正相杂交：探针分子固定于芯片表面，与液相的靶分子进行反应。但这种方式不仅使得检测过程平行化，可以同时检测成百上千的基因序列，而且由于集成的显微化，使得杂交所需的探针及待测样品均大为减少，杂交时间明显缩短。检测：对于荧光标记芯片应用荧光显微镜或激光共聚焦扫描仪等采集各杂交点荧光信号如位置和强度；同位素标记多采用放射自显影检测杂交信号；最近发展的纳米金标记，通过银放大后可直接在裸眼或普通光学显微镜下观察。最终再用相关软件进行信号的分析处理，得出待测样品的核酸信息。2.4数据收集和分析将经荧光或激光共聚焦扫描得到的图像输入计算机，按不同的研究目的，用专门软件对杂交产生的印迹进行数据的自动化处理和定量分析。其基本步骤为样品斑点的确定、图像背景的识别和扣除，所得的数据经正态化后，进行统计分析，得到基因的表达图谱。3基因芯片在环境保护中的应用3.1微生物群落研究中的应用3．1.1探究群落中微生物的意义微生物在生态系统的功能和持续中起着极其重要的作用，了解微生物群落的结构和组成以及它们对环境干扰的反应和适应性，对于维持和恢复生态系统理想的生态功能是很重要的环境微生物群落研究包括环境样品的微生物分布、种类、功能、动力学变化及气候、环境污染等环境因素改变对其微生物生态的影响等。3.1.2基因芯片技术用于环境微生物研究具有更多优势与传统的核酸检测技术相比，基因芯片技术用于环境微生物研究具有更多优势：首先，DNA或寡核苷酸为基础的基因芯片技术是研究功能基因组学的有力工具，它允许研究者全面地研究不同条件下活细胞的生理学。第二，基因芯片技术不需要知道保守序列，不同种群的同一功能组的所有多态性基因序列可以构建在芯片上，并且以此作为探针来检测它们在环境样品中的的相应分布。第三，不需要枯燥费时的配对杂交。第四，基因芯片需要的样品量少，适宜于环境微生物检测。第五，基因芯片具有定量特性。基因芯片在环境微生物研究中的应用处于起步阶段，但是，芯片技术在环境微生物研究中的应用将加速复杂环境微生物系统的生态、生理、结构和功能的了解。3.1.3常用基因芯片的种类４（1）系统寡核苷酸芯片系统寡核苷酸芯片建立在系统标记基因如rRNA基础之上。rRNA是研究细菌进化和亲源关系的重要指标，是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。16SrRNA是最常用的作为细菌群落结构分析的系统进化标记分子。它由多个高度保守的区段和可变区段组成，保守性序列基本保守，反映生物物种的亲缘关系，因此可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片段扩增出来；高变性则揭示生物物种的特征核酸序列，其序列因不同细菌而异，因此可利用可变区序列的差异来设计不同菌属、菌种的探针。系统寡核苷酸芯片是目前应用最广的一种基因芯片，利用该技术已经成功对堆肥、土壤、活性污泥、铀污染含水土层等环境样品进行了微生物检测、菌群动力学、多样性和结构分析。(2)功能基因芯片功能基因芯片通常建立在催化生化反应的关键功能基因之上，这些基因包括了那些与研究对象有确定关系的基因，或至少是与研究对象的关系有待考证的基因。作为FGA候选基因应该具有的特点：(1)该基因是参与生化过程的关键酶或蛋白质编码基因；(2)进化保守但在不同微生物之间具有足够的变异，从而可以对不同菌株设计探针；(3)不同的基因在数据库的序列信息量是不同的，应该选择在公共数据库中具有翔实序列信息的有关基因。根据FGA的目的及其杂交靶标的种类，FGA分为功能分类基因芯片和基因表达芯片。前者的