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现代生物医学研究方法进展1、HowtoexamineproteintransportfromERtoGolgi?答：一个哺乳动物细胞含有近1万种、约1010个蛋白质分子。除了少数蛋白质在线粒体核糖体上合成外，绝大部分蛋白质是由细胞核DNA编码、并在细胞质基质的核糖体上合成的。蛋白质在胞质游离核糖体上起始合成后，转移到糙面内质网，新生肽边合成边进入糙面内质网腔中，经过一些加工如折叠，组装，加上一些糖基团等，才能成为较成熟的蛋白质。然后这些蛋白质被转移到高尔基体腔内，做进一步加工，整个过程中由线粒体共能，最终完成成熟的蛋白质。而有生命的细胞若是要正常运作，则必须将这些成熟蛋白质运送到细胞内的各个位置。对蛋白质分选与运输感兴趣的研究工作者来说，能检测分析蛋白质从内质网转运到高尔基体加工的过程是非常兴奋的一件事。新合成的蛋白质离开内质网后，在运输他们到各自最终的位置之前都要先经过高尔基复合体进行一系列的加工。传统的方法已经证明蛋白质这种运输方式在生物化学上的必要性，并且确定了“运输中间体”的作用。目前，新的荧光标记蛋白技术使我们有可能追踪到活细胞中的单一运输中间体的整个生命过程，包括它们的形成，途径以及到达高尔基复合体中的速度。有研究者在病毒糖蛋白ts045VSVG上加上绿色荧光蛋白（GFP）标签，从而可以使蛋白质从内质网到高尔基体上的运输变得直观可视化。从包疹性口炎病毒突变株ts045获得的VSVG蛋白已经被广泛应用到膜运输的研究中，这主要是因为当温度达到40°时，VSVG在内质网发生可逆错折叠和滞留；而当温度降到32°时，它可以脱离内质网而进入高尔基复合体。实验结果显示把COS细胞40°培养时，融合蛋白VSVG-GFP基本都出现在内质网，而把温度降到32°培养15分钟，融合蛋白会重新定位，进入高尔基复合体。而绿色荧光蛋白GFP连接在VSVG蛋白地胞质尾区，因此可以利用GFP的荧光，用共聚焦显微镜等高分辨率，并且可以看到荧光标签的显微镜来直接观察荧光的路径，速度以及荧光强度，从而可以直观看到蛋白质从内质网到高尔基体的运输过程。利用荧光成像得到的结果显示，从内质网中输出来之后，VSVG-GFP开始集中形成很多不同形状，并快速形成一种前高尔基体的结构，它会向内改变位置沿着微管蛋白移向高尔基体。在前高尔基体结构转移大高尔基体复合物的过程中，没有任何的荧光信号的损失，并且他们迅速伸直变成一种管状的结构。2、Ofproteinpurification,couldyoupleasedescribethefundamentalsandapplicationsofAmmoniaSulfate(AS),IonExchanger,GelFiltrationandAffinityColumnthroughglycophorinE,adimerictransmembraneproteinasanexample.答：蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。下面主要以血型糖蛋白E(glycophorinE)为例，简要介绍下几种蛋白纯化方法，包括硫酸铵（AS）法分级纯化蛋白、离子交换、凝胶过滤和亲和层析等。硫酸铵（AS）沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+,SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。那么在纯化glycophorinE时，可以先使用不同浓度的硫酸铵如30%、40%、50%、60%、80%来沉淀目的蛋白，然后跑westernblot或者测下其活性，检测蛋白在哪个浓度中量最大或者活性最强，这样就可以确实硫酸铵的最适浓度，达到最大纯化效果，初步纯化蛋白glycophorinE。离子交换层析（Ionexchanger）技术是是一种建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上的分离方法，它依赖于分离系统的PH高于被分离物质的PI时，被分离物质带负电荷，可被阴离子交换剂结合，相反，则同阳离子交换剂结合。生物分子表面所带电荷即使有很小的差别，也足以采用离子交换层析技术把它们分离开来。蛋白质和酶都具有电解质性质，故可用离子交换剂进行分离提纯，特别是经过了初步纯化后的蛋白质和酶采用此法效果尤为显著。而glycophorinE在它的唾液酸中含有大量的负电荷，整个分子呈负电荷状态，在经过硫酸铵（AS）沉淀法初步纯化glycophorinE后，可以用阴离子交换剂如DEAE-纤维素进行进一步纯化。凝胶过滤层析（Gelfiltration）又称分子筛过滤、排阻层析等，是一种按分子量大小分离物质的方法。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。凝胶过滤层析的原理是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中，用缓冲液洗脱。根据各组份的分子大小不同，在凝胶上受阻滞的程度不同。也就是蛋白质的大小不一，而凝胶上有大小不一的孔，大的蛋白质在凝胶中不进入孔内直接下来，速度最快，中等大小的进入大孔中，下来速度较慢，小的蛋白质则进入大小孔中，下来速度最慢，从而达到分离的目的。亲和层析（affinitycolumn）一种吸附层析，将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。其原理是利用抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。那么将与glycophorinE有高特异性结合的分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，让含有glycophorinE的蛋白混合液通过层析柱，则glycophorinE将会被吸附，而其他组分直接流出。然后用适当的缓冲液将glycophorinE洗脱下来，这样就可以进一步地纯化该蛋白。3、Thecomputer-assistedsearchfordistalenhancersdescribedinProf.Zhou’slecturedoesnotworkwellforthosegenesthatemergedonlyrecentlyinevolution(e.g.onlyinprimates).Why?答：增强子是一个重要的转录调控因子，它是通过启动子来增加转录的。1981年Benerji在SV40DNA中发现一个140bp的序列，它能大大提高SV40DNA/兔β—血红蛋白融合基因的表达水平，这是发现的第一个增强子。增强子可分为细胞专一性增强子和诱导性增强子两类：①组织和细胞专一性增强子。许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。②诱导性增强子。这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。近年来，通过计算机辅助系统来寻找增强子成为生物研究的重要方法。如下图：而计算机辅助系统实际上也是借助于生物信息学来完成的。生物信息学(Bioinformatics)是研究生物信息的采集，处理，存储，传播，分析和解释等各方面的一门学科，它通过综合利用生物学，计算机科学和信息技术而揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。1990年代以来，伴随着各种基因组测序计划的展开和分子结构测定技术的突破和Internet的普及，数以百计的生物学数据库如雨后春笋般迅速出现和成长。随着人类基因组测序工作的完成，各种模式生物基因组测序的完成，生物科学的发展已经进入了后基因组时代，基因组学研究的重心由基因组的结构向基因的功能转移。这种转移的一个重要标志是产生了功能基因组学，而基因组学的前期工作相应地被称为结构基因组学。利用计算机辅助来寻找基因远处的增强子是利用生物信息学来处理解决问题的好手段。数据库中总结包含了所有前人得到的数据结果，利用计算机辅助来统计分析，从而得到在基因组哪个区域上可能成为增强子的区域，从而缩小试验范围，大大减轻实验任务。而能够利用计算机来辅助寻找增强子的原理就在于，在漫长的生命进化过程中发现，增强子的序列具有很大程度上的保守性，从而能够预测出来。但是这种方法有一个局限性在于，它只能够分析那些比如灵长类的在生命进化史上进去出现的物种。原因就在于，数据库总结分析前面所研究得到的数据结果，从而得到一个分析方法和方程式，计算机根据利用这个统计分析来处理想要研究的目的基因的增强子区域，从而得到结果。但是如果是早期的物种的话，其基因组序列会有很大的差别，无法利用现存在的方程式来解决分析。4、请简述自由基的产生途径和检测方法。答：自由基，机体氧化反应中产生的有害化合物，化学上也称为“游离基”，是化合物分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团，如氢自由基（H·）。自由基具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病和衰老效应。在生物体内，自由基来源有二：一是细胞正常生理过程产生；二是化学毒物在体内代谢过程产生。正常情况下，机体会产生自由基，参与某些生物学功能的发挥，并且机体的自由基清除系统可使自由基的产生和消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体没有损害作用，只有当自由基过度产生或机体的抗氧化防御体系的功能减弱或丧失时，自由基才会产生损害作用。自1900年首次发现三甲苯基自由基以来，自由基参与生命过程中许多重要的生化反应逐步为人们所认识，特别是随着现代检测分析技术的日新月异，自由基在生物和病理学领域的作用研究迅速发展。而寻求简便、快速、准确、高效的自由基检测方法成为研究自由基生物学作用的关键。目前主要有以下几种检测方法：（1）自由基相关酶的测定机体内清除自由基的酶系统主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）等酶类组成。在正常情况下，机体代谢过程中产生的超氧阴离子自由基被细胞的SOD歧化成为H2O2，后者再由细胞浆的CAT和GSHPx催化降解为水和氧。SOD属于金属酶，其底物超氧阴离子自由基寿命极短，一般都采用间接地活力测定法来测定SOD。主要有邻苯三酚自氧化法（Marklund法），采用420nm处光吸收测定；亚硝酸盐形成法，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度；极普氧电极法，利用系统产生超氧阴离子自由基过程中消耗O2，而一定量的SOD又会使超氧阴离子自由基歧化产生O2，从而使耗氧量减少，使用电谱氧电极仪精确测出耗氧量而推算出酶活力。CAT的作用是降解细胞内的O2，测定CAT的方法有滴定法、极谱氧电极法等。GSHPx是一种含硒酶，测定其活力的方法是Hafeman法及其改良法，可以直接测定酶促反应中GSH的减少量，以此计算GSHPx的活力单位。（2）化学发光法测定在有氧化剂，如氧、H2O2、阴离子自由基以及其他过氧化物存在下，化学发光剂可以被氧化，产生电子激发态的中间产物，当其返回基态时，即产生化学发光。（3）荧光分光光度法测定自由基的中间产物不饱和脂肪酸是自由基的易攻目标之一，氧自由基作用于脂质