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基金类型□科研基金■中青年人才基金□青年基金科学技术发展基金申请书项目名称：大黄素对肝纤维化大鼠PDGF－B、TGFβ1的影响申请人：工作部门：申请日期：一、简表计算机录入号研究课题名称大黄素对肝纤维化大鼠PDGF－B、TGFβ1的影响项目研究类别●基础研究○●应用研究○试验开发○其他申请金额10，000元起止年月2003年10月至2005年05月申请者姓名性别●男○女职称（或职务）主治医师学位专业消化内科出生年月19年月工作部门消化内科项目组合作单位总人数高级中级初级博士生硕士生辅助预期成果形式●论文、专著○报告○新技术方法○新产品○其他主题词研究内容（1）主题词不多于3个（2）主题词之间用逗号隔开肝纤维化，血小板源生长因子B，转化生长因子β1本课题以不同剂量大黄素干预四氯化碳（CCL4）制备的肝纤维化大鼠模型，通过免疫组织化学ABC法检测肝组织血小板源生长因子B（PDGF－B）、转化生长因子β1（TGFβ1）表达的变化，探讨大黄素抗肝纤维化作用的可能机制，为其临床研究、应用奠定基础。二、研究课题说明1.本研究课题的科学依据和意义(国内外研究概况、水平和发展趋势，立题的依据、学术特点和创新之处，意义和应用前景，主要参考文献目录和出处)：慢性肝病是十分常见的疾病，肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经病理过程，而肝硬化是危害人类健康的严重疾病。目前许多慢性肝病的病因尚无理想的针对措施，如乙型肝炎病毒，而肝纤维化是可逆的，肝硬化是不可逆的，因此寻求有效的防治肝纤维化药物、探讨其作用机制对防治肝硬化具有重要的理论意义和临床应用价值。肝纤维化是指肝脏内纤维性结缔组织异常增生，是慢性肝病最重要的病理特征，它是一种对损伤的修复反应，但过度的纤维化可使肝小叶结构紊乱，肝细胞总数减少。肝纤维化的发病机制尚不明了，目前认为[1~4]：（1）肝纤维化是各种原因引起的肝脏创伤修复反应，是由细胞外基质合成过多或降解减少所致，其主要病理特征为大量细胞外基质在肝组织中沉积，肝星状细胞（HSC）是肝纤维化细胞外基质的主要来源细胞；（2）HSC活化伴随的增殖、大量细胞外基质产生及有关细胞外基质降解酶合成异常等功能改变是肝纤维化形成的关键；（3）HSC可被损伤肝细胞、枯否细胞及活化的HSC等产生的细胞因子、氧自由基及其细胞外基质降解酶合成异常引起的细胞外基质改变所激活。其中细胞因子在肝纤维化中的作用引起了广泛重视，大量研究证实，肝纤维化形成过程中受到众多细胞因子调节，对细胞间质，尤其是胶原蛋白代谢有重要调控作用。实验证明，血小板源生长因子B（PDGF－B）是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞分裂增殖的能力。肝受损时，（1）大量分泌的PDGF－B刺激HSC增殖，转化为肝纤维样母细胞，合成大量细胞外基质沉积于肝细胞间质，促进肝纤维化发生；（2）PDGF－B能够促进肌纤维样母细胞产生胶原，尤其是Ⅰ型及Ⅲ型胶原；（3）PDGF－B通过上调组织金属蛋白酶抑制剂抑制胶原酶的作用，以减少细胞外基质的降解[5]。此外肝脏受损后，经内皮细胞活化处理的转化生长因子β1(TGFβ1)也以旁分泌或自分泌的方式参与肝纤维化形成,其机制为（1）诱导肝细胞凋亡；（2）活化HSC和刺激其自分泌PDGF－B，并能增强HSC血小板生长因子受体的表达，从而促进PDGF－B对HSC的增殖；（3）增加Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白合成，并促进纤维连结蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、细胞粘和素、delorin和biglycan等细胞外基质成分的合成；（4）抑制基质蛋白酶的产生，从而减少细胞外基质降解，刺激结缔组织生成[6]。目前国内外仍无理想的抗肝纤维化药物用于临床治疗，探讨中草药及其有效成分治疗肝纤维化已是国内防治肝纤维化研究的热点。大黄素（Emodin）是从大黄中提取的主要有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、增强机体免疫机能等多种药理作用[7～10]。近年来还发现大黄素对四氯化碳（CCL4）制备的肝纤维化大鼠模型具有治疗作用，可改善肝功能、降低血清透明质酸、层粘连蛋白、胶原蛋白等肝纤维化血清学指标、缓解肝组织纤维化程度[11～12]，但其作用机制尚不明确。本研究以不同剂量大黄素干预CCL4肝纤维化大鼠模型，通过免疫组织化学方法检测肝组织PDGF－B、TGFβ1表达的变化，探讨大黄素抗肝纤维化作用的可能机制，为临床研究、应用奠定基础。参考文献：1.FiedmanSL.CelluarNetworksinhepaticfibrosis.Digestion,1998;59:368~3712.HerbtH,WegeT,MilaniS,etal.Tissueinhibitorofmetalloproteinase-1and-2RNAexpressioninratandhumanliverfibrosis.AmJPathol,1997;150:1647~16593.Alcolado.Pathogenesisofliverfibrosis.ClinicalScience,1997;92:103-1124.FriedmanSL.Stellatecellactivationinalcoholicfibrosis—anoverview.AlcoholClinExpRes,1999;23:904~9105.王萍.血小板衍生生长因子与肝纤维化[J].国外医学消化疾病分册,2000;20(1):406.BreitkopfK,LahmeB,TagC,etal.Expressionandmatrixdepositionoflatenttransforminggrowthfactorβbindingpretintsinnormalandfibroticratliverandtransdiffurentiatinghepaticstellatecellsinculture[J].Hepatology,2001;34(3):387~3967.HatanoT,UebayashiH,ItoH,etal.PhenolicconstituentsofCassiaseedsandantibacterialeffectofsomenaphthalenesandanthraquinonesonmethicillin-resistantStaphylococcusaureus.ChemPharmBull,1999;47:1121~11278.邹洪,袁倬斌.大黄素的极谱行为及应用研究.药学学报,1997;32:310～3139.刘彦株,罗国安.大黄素、大黄酸对平滑肌细胞增殖抑制作用研究.生物物理学报1998;14:240～24410.ZhangL,HungMC.SensitizationofHER-2/neuoverexpressingnon-smallcelllungcancercelltochemotherapeuticdrugsbytyrosinekinaseinhibitoremodin.Oncogene,1996;12:571~57611.展玉涛,魏红山,王志荣,等.大黄素对鼠肝纤维化肝功能、层粘连蛋白及透明质酸的影响.中国中医药信息杂志;2000;7(4):3512.展玉涛,魏红山,王志荣,等.大黄素抗肝纤维化作用的实验研究.中华肝脏病杂志,2001;9(4):235-2362.研究内容和预期成果：（说明工作的具体内容，指出重点应解决的科学和技术问题，阐述预期的成果在学术、社会和经济等方面的影响。）研究内容：1）大黄素对肝纤维化大鼠PDGF－B表达的影响2）大黄素对肝纤维化大鼠TGFβ1表达的影响重点解决的问题：1）肝纤维化动物模型的建立2）免疫组化ABC检测方法的熟练应用预期成果：1）探讨大黄素抗肝纤维化的可能机制，为其临床进一步研究、应用提供理论依据；2）发表论文2~3篇。3.具体研究方法和技术路线、研究工作时间进度表安排：研究方法：1）将SD大鼠50只分为5组，除正常对照组外，每组给予CCL4皮下注射造模，治疗组同时分别给予低、中、大剂量大黄素混悬液灌胃共42天。2）以免疫组化ABC法分别检测各组肝组织PDGF－B、TGFβ1的表达技术路线：50只SD大鼠资料总结，统计分析，撰写论文，论文发表及交流，结题时间进度表2003.10～2004.03收集资料、联系购买试剂2004.04～2004.10购买SD大鼠、进行造模和干预并检测相应指标2004.11～2005.02总结试验结果、撰写论文2005.03～2005.05结题、准备进一步的研究方向每组首次皮下注射40％CCL40.5ml/100g体重，以后注射0.3ml/100g体重，3天一次，共42天造模，治疗组同时给予不同剂量大黄素混悬液灌胃，每天一次，共42天正常对照组10只以免疫组化ABC法分别检测各组肝组织PDGF－B、TGFβ1的表达低剂量大黄素组10只中剂量大黄素组10只大剂量大黄素组10只模型对照组10只三、项目深入研究及成果转化计划四、课题研究组成员表姓名性别年龄专业技术职务（或职称）专业工作部门分工每年用于本项工作月数签字男总负责女教授、主任医师总指导男指导男29硕士研究生动物模型女26硕士研究生动物模型男30硕士研究生免疫组化检测对本项目作进一步深入研究及成果转化计划1．初步探讨大黄素抗肝纤维化的机制，为其临床进一步研究和推广应用提供理论依据；2．进一步探讨大黄素对其它细胞因子及其网络间的影响。五、申请人主要研究成绩简介主要研究工作及成果、主要著作、论文和科技成果名称（应注明出处并详细列出参考资料）六、研究支撑条件研究工作的现有基础和主要设备条件（有利因素和不利因素，以及对其他经费来源的情况作简要说明）：本课题组队伍稳定，梯队结构合理，分工明确，具有良好的科研经验，在既往的科研工作中已经熟练掌握了免疫组化、原位杂交、Westernblot、Northernblot、RT-PCR、反义寡核苷酸质粒构建、筛选、扩增和纯化、流式细胞仪检测、病理染色等多种实验技术。本研究以CCL4诱导的大鼠肝纤维化模型是经典的动物肝纤维化模型，以免疫组化ABC法检测组肝组织PDGF－B、TGFβ1表达的实验方法较为成熟，完全可行，本院中心实验室有先进的医疗设备和专用实验室，能保证课题的顺利完成。七、项目经费预算表申请资助总金额(元)10,0000元其它经费来源及金额(元)来源金额(元)预算支出科目(请按1.小型仪器设备2.试验材料费3.科研业务费4.院外协作费等顺序填写)金额(元)计算根据或理由1.实验材料费2.科研业务费9,0003,0005005,5001,0001004005001.实验动物及饲养费2.实验药品费3.免疫组化检测试剂费文献检索及资料购买费,论文发表及交流费管理及协作费