硫酸软骨素的提取和纯化的研究进展

1硫酸软骨素的提取和纯化的研究进展栾允光赤峰学院化学系，赤峰024000摘要介绍了硫酸软骨素的来源、结构、性质及其生理功能，对硫酸软骨素的提取方法——中性盐法、碱提取法、酶提取法、超声波法﹑乙酸抽提法和纯化方法——溶剂法、季铵盐化合物沉淀法、超滤膜法、色谱法电泳法的具体工艺路线及其优缺点进行了综述。关键词：硫酸软骨素；提取；纯化硫酸软骨素(Chondroitinsulfate)是一种酸性粘多糖，广泛存在于哺乳动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中。硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的双糖聚合物，它通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在，当其水解时发生消去反应，连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的苷键断裂，可以得到游离态的硫酸软骨素。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末,具有吸湿性，易溶于水而成粘度较大的溶液，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落,在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病，与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化性溃疡，与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。[1,2,3]1硫酸软骨素的提取1.1中性盐法先用10%氯化钙提取，氯仿-戊醇（1：4）除去蛋白质，2倍量乙醇沉淀，最后以Lloyd试剂精制。而以透析法除杂质、氯化六氨合钴纯化，或一磷钨酸纯化，均可使工艺简化。以30%氯化钾或30%氯化钾加1%碳酸钾提取，高岭土吸附除去杂蛋白，可提高产品收率。该方法提取的产品较白，各项指标符合国家标准，也不会造成环境污染，但是产率较低，造成原材料的大量浪费，对经济效益有一定的影响。1.2碱提取法（1）浓碱提取工艺将粉碎好的软骨碎片称重后，加入骨质量1.5倍的15%氢氧化钠溶液，室温下进行浸提12～16h（分两次进行），然后用盐酸调pH到2.8～3.2，双层纱布过滤30min，留下滤液。将滤液调节pH到8.5～9.0，2按骨质量的4%加入胰蛋白酶，于50～54℃水解6h，用盐酸调节pH到6.5，升高温度到80～90℃，加入活性炭进行脱色反应，然后过滤，在滤液中加入1.5倍体积的无水乙醇进行沉淀分层4h，所得沉淀即为硫酸软骨素，在60℃下干燥即得最终产品，其产率较高。（2）稀碱提取工艺将粉碎好的软骨碎片称重后，加入骨质量6倍的2%氢氧化钠溶液，60℃下进行浸提24h（分两次进行），然后用盐酸调pH到2.5～3.0，双层纱布过滤，留下滤液。将滤液调节pH到8.5～9.0，按骨质量的4%加入胰蛋白酶，于50～54℃水解7h，用盐酸调节pH到5～7，升高温度到80～90℃，加入0.5%活性炭进行脱色反应，然后过滤，在滤液中加入1.5倍体积的无水乙醇和1.5%的氯化钠溶液进行沉淀分层6h。所得沉淀再次加入1.5%的氯化钠溶液和3倍体积的无水乙醇进行沉淀，所得即为硫酸软骨素，然后在60～65℃下干燥即得最终产品，其产率较高。（3）稀碱稀盐提取工艺将粉碎好的软骨碎片称重后，加入均为骨质量6倍的0.5%氢氧化钠和2%的NaCl混合溶液，室温下进行浸提30h（分两次进行），然后用盐酸调pH到8.5～9.0，加入骨质量4%的胰蛋白酶进行水解。水解后升温到80～90℃，加入骨质量1.5%的滑石粉，过滤；加入1.7倍体积的无水乙醇进行沉淀，过滤后再加入1.5%的氯化钠溶液进行沉淀过滤；加入1.7倍体积的无水乙醇再次进行沉淀过滤，所得沉淀物于60℃下干燥即得最终产品，其产率相对较高。（4）稀碱浓盐提取工艺将粉碎好的软骨碎片称重后，加入骨质量5倍的0.4%氢氧化钠和20%的氯化钠混合溶液（pH为13），室温下进行浸提30h（分两次进行），用盐酸调pH到7.8，升温到80～90℃，加入骨质量4%的滑石粉，将盐解液调节pH到2～3，过滤1h，将滤液加入1.5倍体积的水进行稀释，同时调节pH到6.5，加入1.7倍体积的无水乙醇沉淀12h，将沉淀物加入1.5%的氯化钠溶液进行沉淀过滤，加入1.7倍体积的无水乙醇再次沉淀8h，所得沉淀物于60℃下干燥即得最终产品，其生产周期长但产率较高。以上4种工艺路线制得的硫酸软骨素含量和氨含量都符合原料药的要求。但是，这4种路线都存在有缺陷：采用稀碱温和条件下制备的样品溶液混浊，且时间长，污染严重，其原因在于该条件下软骨中的胶原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去。最主要的是这些工艺的生产周期都太长，极大地限制了工厂的生产效益和经济效益。1.3酶提取法（1）稀碱-酶解提取法邹开朗等[4]提出稀碱与酶解相结合法生产硫酸软骨素。先将软骨在80℃水中煮4～6h，然后按原料（干质量）与2%氢氧化钠的比例为1∶6.25的量加入氢氧化钠溶液，室温提取1.5h，然后用盐酸调pH到6～6.5，双层纱布过滤；留下滤液，滤渣再以1∶0.12的质量比加入2%的氢氧化钠溶液，于40℃下提取lh，再用双层滤布过滤；弃滤渣，取滤液。合并2次滤液，并测量体积待用。滤液调节pH到8.0～9.0，按滤液与胰酶1000∶0.5的比例加入胰酶，于40～50℃水解lh后，再按1000∶0.5的质量比加入胃蛋白酶，40～50℃水解1.5h，过滤后加入高岭土和活性炭吸附。用氯仿反萃取法萃取滤液，留水层。调水层pH至6.8～7.2，再加入2.5倍体积的95%以上乙醇沉淀，即得硫酸软骨索。该工艺用氯仿反萃取的方法纯化硫酸软骨素，与其他提取方法相比较，缩短了一半工艺流程，同时提高了纯度和提取率，又减轻了碱法提取所带来3的环境污染。LignotB等在干软骨与水的料液比为9∶100的体系中加入2.0g酶制剂（Lypaine酶），酶解条件为pH3.5，温度65℃，酶解3h，可得到纯度为31%的硫酸软骨素。马淑涛等[5]将冷冻的新鲜猪喉骨用稀碱溶液提取后，使用原料量的0.15%的胰酶，在pH为8.5～9.0、温度为50℃的条件下进行酶解，得到含氮量仅为3.16%的提取物。奚俊等[6]采用稀碱法提取家畜的鼻骨和气管中的硫酸软骨素，按原料量的0.05%加入胰酶和木瓜蛋白酶，当酶解温度为40～50℃，pH分别为8.0～8.5和5.7～6.1时，可得到含氮量仅为3.5%的提取物。（2）浓碱-复合酶酶解提取法该法的实验流程与稀碱酶解法基本一样，只是在碱解这一步增大了碱的浓度。高华等[7]应用该法生产了硫酸软骨索，研究得出优化的试验条件。碱提取的最佳条件是按软骨与1mol/L氢氧化钠溶液质量比1∶2混合，温度控制在45℃，搅拌提取2h。复合酶酶解工艺的适宜条件为按复合蛋白酶与料液1∶1000的质量比加入蛋白酶，控温40～50℃，保持溶液pH8.5～9.0，水解4h。在最佳试验条件下，得到硫酸软骨素为白色粉末，产品纯度达95.2%，收率为32.6%。该工艺提高了产品纯度和收率，降低了生产成本。（3）复合酶酶解提取法王凤琴等[8]用复合酶解法提取硫酸软骨素。把猪肋、喉、气管等软骨预处理后，以骨粉1∶3的比例加入去离子水，加入原料量1%的复合酶，于55℃搅拌酶解12～15h。复合酶水解液用盐酸调pH7.5，加入2%的醋酸钠溶液，搅拌溶解后，升温到85℃，保温20min，过滤去残渣。滤液加入胰酶酶解.经酶解后的酶解液在85℃下维持15min，过滤，乙醇沉淀，干燥磨粉后得成品。影响该工艺水解反应的因素为酶解温度、pH值与加酶量，利用正交试验得出优化条件为温度50℃、pH8.6～8.9、加酶量0～39L，收率达17.84%。采用全新的双酶酶解工艺和中空纤维超滤等现代技术生产硫酸软骨素，由于酶作用专一性强的特点，质量稳定、收率高，产品颜色洁白，生产周期较短。（4）酶解-树脂提取法[9]将鲸鱼软骨绞碎，加1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡，40℃保温水解2h或加pH为7.5的水浸泡，用蛋白酶55℃保温水解20h，再加盐酸中和至近中性，过滤，调整滤液中NaCl浓度达到0.5mol/L后，将溶液通过离子交换树脂柱吸附完毕，用0.5mol/L的NaCl液洗涤，再用1.8mol/L的氯化钠液洗脱，流速2L/h，洗脱液脱盐，乙醇沉淀，离心分离，收集沉淀，真空干燥，即得成品。应用此工艺制得的硫酸软骨素样品，经纸电泳检查为单一区带，抗原物质试验结果为阴性，含硫量为7.2%。其优点是酶水解或稀碱水解与树脂交换技术相结合，保证了硫酸软骨素分子不降解，解决了成品纯度的问题。目前，国内各生产厂家常选用酶解法进行硫酸软骨素的制备。这种方法相对来说产率较高，纯度也较高，生产周期较短，且对环境污染较小，是比较理想的制备方法。1.4超声波法蒲志军等[10]利用超声波法制备硫酸软骨素，其原理是在碱性条件下蛋白质易离解和超声波的热学机制促使蛋白质快速解离而达到去杂蛋白的目的，升温（85～90℃）均能使解离的蛋白质变性吸附到白陶土上，从而使硫酸软骨素与蛋白质分离，提高产品质量。以猪喉骨为原料，在对其进行预处理后，使用超声波手段进行稀碱抽提，浸出液再用超声波二次处理使杂蛋白解离，经白陶土和活性炭去杂脱色，酒精沉淀后，干燥即得合格的硫酸软骨素。用该工艺方法提取、除杂时间约需3h，大大缩短了生产周期，节约了生产成本（不使用酶），而且提取和除杂过程无需加热，操作起来比较简便。但是该工艺在抽提过程中，超声4波处理时间不能太长，否则很多杂质会跟着离解出来，从而增加去除杂质的难度，并使产品的色泽和质量达不到要求，且该工艺收率偏低，限制其在生产上的广泛应用。1.5乙酸抽提法利用乙酸水溶液提取硫酸软骨素。先把鲜软骨上的脂肪、肉及其他软组织去掉，在-20℃冷冻，使用前在4℃解冻。把软骨放在水中，用乙酸调节pH为4.5，在37℃下抽提7h。抽提液沸腾浓缩后，在90℃下干燥即得硫酸软骨素粗品。影响硫酸软骨素浸出率的主要影响因素是pH值。该工艺流程简单，成本较低，可以考虑商业化大规模生产。但是目前在国内还没有厂家用这种工艺生产硫酸软骨素。在上述提取方法中，中性盐法的产品得率太低，经济效益不高。碱提取法制得的硫酸软骨素含量和氨含量都符合原料药的要求。但是，采用稀碱温和条件下制备的样品溶液混浊，且时间长，污染严重，其原因在于该条件下软骨中的胶原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去。最主要的是这些工艺的生产周期都太长，极大地限制了工厂的生产效益和经济效益。酶解法相对来说产率较高，纯度也较高，生产周期较短，且对环境污染较小，是比较理想的制备方法。但应用酶解法制备出来的产品很多还不能满足出口质量要求，所以还需要对制备方法进行改进，以适应国外的需求。2硫酸软骨素的纯化2.1溶剂法溶剂法是利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软骨素与其他杂质相互分离的纯化方法。马淑涛等调节硫酸软骨素溶液pH为5.0～6.0后加入氯化钠至其浓度为1.5%(m/v)，再加入乙醇至其浓度为60～70%，可得到纯度为70～78%的硫酸软骨素。NicolaV将硫酸软骨素溶于浓度为2%(m/v)的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较高纯度的硫酸软骨素。采用甲醇或丙醇时，也可得到同样的效果。2.2季铵盐化合物沉淀法硫酸软骨素在溶液中以聚阴离子形式存在，与季铵盐化合物(如溴化十六烷基三甲铵或氯化十六烷基吡啶等)可形成水溶性很小的季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离并溶解，利用该性质可使硫酸软骨素得到纯化。该纯化法一般需要控制硫酸软骨素的浓度为0.1～1.0%(m/v)，浓度过高，会使季铵盐化合物与其中的杂质发生沉淀反应。KazuakiK等采用浓度为5mg/mL的氯化十六烷基吡啶纯化10