碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展

中国畜牧兽医2011年第38卷第1期遗传繁育·157·碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展王秋颖(河北旅游职业学院,河北承德067000)摘要:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)是一种非特异性磷酸单酯酶,能催化磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖,也能催化磷酸基团的转移反应。AP广泛存在于微生物和动物体内,在磷生物地球化学循环过程中有重要作用,并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。作者对碱性磷酸酶的研究历史、催化作用机制及其应用进行了综述。关键词:碱性磷酸酶;非特异性磷酸单酯酶;催化作用机制中图分类号:Q50文献标识码:A文章编号:1671-7236(2011)01-0157-04碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,EC3.1.3.相似的作用机制。另外,功能相似的磷酸二酯酶,如1,AP)是非特异性磷酸单酯酶,可以催化几乎所有蜡状芽孢杆菌中的磷脂酶C、桔青霉中核酸酶P1,的磷酸单酯的水解反应,生成无机磷酸和相应的醇、它们的活性部位和金属离子结合位点与大肠杆菌酚糖等还可以催化磷酸基团的转移反应且大肠AP相似。所以,大肠杆菌AP还可作为其它磷酸酯、,,杆菌AP还是一种依赖亚磷酸盐的氢化酶(Yang酶和以金属离子作辅助因子的磷酸酯酶的研究等2004AP存在于除高等植物外几乎所有的生模型。,)。在钙磷的消化吸收1.1大肠杆菌碱性磷酸酶的一级结构大肠杆菌物体内可直接参加磷代谢、,,、、分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。1911年AP是由两条多肽链组成的同型二聚体金属蛋白Levene等、1912年Grosser等分离到(碱性)磷酸酯酶,每个单体包含449个氨基酸,单体分子质量47酶;1934年,Davis提出了碱性磷酸酶这一命名;ku,有3种同工酶:同工酶1的NH2-末端有一个1958年,Agren等用同位素标记的方法分离到磷酸Arg残基,同工酶3的NH2-末端无Arg残基,同工丝氨酸;1961年,Schwartz在大肠杆菌中也发现了酶2是这两种形式的异源二聚体。AP单体在细胞这一复合物,并认为丝氨酸可能是AP活性部位的中合成后,在富含亮氨酸的N末端信号序列的引导组成成分;1962年,Plocke等证实AP是一种金属下,定位在周质间隙并二聚化,成为有催化活性的酶酶;1981年,Bradshaw测定了大肠杆菌AP氨基酸分子。大肠杆菌AP分泌过程是由具有ATP酶活全序列,并克隆了大肠杆菌AP的基因phoA;之后性的分泌蛋白SecA和陪伴蛋白SecB催化多种生物AP的基因相继被克隆,近些年对AP的(Khokhlova等,2004)。Kononova等(2000)研究结结构、作用机制和功能的研究越发深入,使AP的应果证明,AP输出信号不仅存在于AP前体,也存在于成熟AP的N-末端,且其一级结构会影响AP分用更加广泛。作者对碱性磷酸酶的研究历史、催化泌功能和酶活力。作用机制及其应用进行了综述。1.2大肠杆菌碱性磷酸酶的空间结构1973年,1大肠杆菌碱性磷酸酶20世纪80年代相继完成了大肠杆菌AP、人胎Knox等首先解析了大肠杆菌AP的7.7三维结盘型AP、人肝/骨/肾型AP、人小肠型AP和酿酒酵构;1985年,Sowadski得到2.8结构;1991年,Kim等将分辨提高至2.0;2000年,Stec等得出母AP氨基酸序列的测定,通过序列比较发现相似性为25%～30%,活性部位高度保守,都保留了1.75结构,更详细的阐明了酶分子的活性部位和Ser102残基、Arg166及金属离子配体,这些保守的催化反应机制。大肠杆菌AP整个分子约100×50×50,每个单体各有一个活性部位;酶分子与催化活性相关的基团暗示了不同来源的AP具有整体上呈现出α/β拓扑结构,分子中央是10层β折收稿日期:2010-07-08叠片,两侧有15个长度不等的α螺旋,分子顶部还作者简介:王秋颖(1976-),女,河北人,硕士,讲师,主要从事生有一个3层β折叠和一个小的α螺旋;每个活性部物大分子结构与功能关系研究。位都是一个凹槽,在酶表面开口,活性部位对磷酸·158·遗传繁育中国畜牧兽医2011年第38卷第1期基、反应产物和竞争性抑制剂有很强的亲和性,但没有磷酸单酯R-基团的明显结合位点,符合AP是非特异性磷酸单酯酶这一特点(Kim等,1991)。活性部位由Asp101-Ser102-Ala103、3个在空间上相靠近的金属离子及配体、Arg166及其它一些相邻氨基酸残基组成。3个金属离子Zn1、Zn2和Mg2+的大肠杆菌AP的活性最强,如果被其它离子代替,活性将会降低约5000倍,但枯草芽孢杆菌等的AP在Co离子存在下才表现出最大活性(Wang等,2005)。大肠杆菌AP中金属离子排列成一个三角,创造了一个正电性环境,为吸引和稳定底物创造了条件,其中Zn1位点的Zn2+在催化反应中激活一个水分子作为亲核物质进攻磷酸丝氨酸共价中间物,并有助于RO-基团的解离;Zn2位点的Zn2+靠近Ser102,在反应中激活Ser102作为亲核物质进攻底物;Mg2+对于Ser102亲核物质的形成,稳定酶分子在它的最大活性构型上发挥了重要作用(Stec等,2000)。1.3大肠杆菌碱性磷酸酶的催化作用机制AP催化磷酸单酯水解或磷酸基转移的反应如图1。首先形成共价中间体(E-P),这一共价中间体随后水解为非共价复合物(E·Pi)。如果有磷酸受体存在(如Tris或乙醇胺),该酶就会表现出催化磷酸基转移的活性,将磷酸基转移给醇生成新的磷酸单酯。反应的限速步骤受pH的影响,酸性条件下,E-P水解是限速步骤,而碱性条件下的限速步骤是E·Pi中磷酸基的解离(Holtz等,1999)。图1碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解或磷酸基转移的反应示意图单纯酶的活性部位是被3个水分子占据,和镁配位的氢氧根离子与Ser102的羟基Oγ形成氢键,酶与底物(ROP)结合成复合物(E·ROP),Ser102位于解离基团的对面,为了亲核进攻Oγ需要脱质子化,为此它将质子转移给与镁配位的羟基,形成镁与水分子的配位,同时,Zn2也与Ser102的Oγ配位,使之稳定在亲核状态。AP的催化机制包括两次置换反应:①被激活的Ser102羟基进攻E·ROP复合物的磷中心,形成共价酶磷中间体(E-Pi),E-Pi的形成引起磷中心构象的改变,RO-基团解离,Zn1通过底物的桥接氧原子参与此步置换促使RO-基团离开;②与Zn1配位的亲核氢氧根进攻E-Pi,水解磷酸丝氨酸中间物,生成非共价酶磷复合物E·Pi,同时亲核的Ser102再生,并导致第二次磷中心构象的变化。1.4大肠杆菌碱性磷酸酶的功能AP确切的生理功能还不十分清楚,但认为它对有机体内磷代谢的调节有重要作用。大肠杆菌AP的结构基因是phoA,它是pho调节子的一部分,pho调节子主要调节磷的转运和代谢。Phobox是pho调节子所有基因启动子区域的共有序列,受PhoB蛋白的调控。phoB基因产物直接激活pho调节子的转录,而PhoB蛋白又被PhoR蛋白磷酸化激活。细胞外磷的水平是调控PhoR的信号,信号传递通过大肠杆菌Pst系统实现。当接收到环境信号后,PhoR再去调节PhoB,而PhoB就是大肠杆菌AP结构基因phoA的直接转录调节者。当处于低磷状态时,PhoR使PhoB磷酸化,激活大肠杆菌AP结构基因phoA的转录;当处于高磷状态时,PhoR会使PhoB去磷酸化以阻止phoA大肠杆菌AP结构基因的转录。2哺乳动物碱性磷酸酶特点哺乳类AP和大肠杆菌AP基本三维结构框架非常相似,与催化活性相关的部位高度保守,2001年获得PLAP的X-射线晶体结构也证实了这一点(LeDu等,2001),所以哺乳类AP与大肠杆菌AP应具有相似的催化机制。但哺乳类AP也有其特点,如哺乳类AP主要为膜结合蛋白,它们通过磷脂酰肌醇葡聚糖锚定在细胞膜外侧;另外,细菌AP是由单基因编码,而哺乳类AP则是多基因编码的,细菌的AP分子两个亚基完全相同,而哺乳类AP分子两个亚基可能不同;哺乳类AP还是糖基化的分子;大肠杆菌AP每个亚基只有4个Cys残基,形成两个链内二硫键,而哺乳类AP有5个Cys残基,表明至少有一个是自由的Cys;Hoylawets等(2006)的研究结果还表明,哺乳类APN-末端的正确折叠及其微环境对于整个分子结构的完整性和催化过程中分子内转变是极其重要的;与大肠杆菌AP结构相比,在人类AP的活性部位,细菌AP的Asp153和Lys328被His替代,Thr155被Ser替代。目前已知人类AP同工酶包括:①组织非特异中国畜牧兽医2011年第38卷第1期遗传繁育·159·性AP(TNAP),来源于肝脏、肾脏、骨及其它脏器和组织,即肝/骨/肾型AP,其中骨型AP是成骨细胞的一种细胞外酶,能被释放到血液循环中,在机体的生理功能主要是在成骨过程中水解磷酸酯,为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸,同时水解焦磷酸盐,解除其对骨盐形成的抑制作用,有利于成骨过程。骨型AP在体内的其它生化功能有待进一步的阐明(Orimo,2010);②肠型AP(IAP)又分胎儿IAP和成人IAP,由肠黏膜上皮微绒毛、肾近曲小管远侧端和子宫分泌,胎儿IAP又称笠原同工酶,它作为肿瘤标志物,出现于肝癌及其它器官发生肿瘤的病人血清中;③胎盘型AP(PLAP)又分早期PLAP和末期PLAP两种形式,主要由孕8周后的胎盘合胞体滋养层细胞微绒毛分泌,肺脏、卵巢、子官、胃肠道及其它脏器也分泌少量的PLAP,PLAP在人体的生理功能主要是参与细胞膜对物质的主动运输及钙、磷代谢,提供胎儿生长发育所需营养,对胎儿的生长发育起着重要作用,动态观察胎盘型碱性磷酸酶活性可作为妊娠的一项指标;④类PLAP又称Nagao同工酶,本质是精原细胞AP(GCAP),是一种肿瘤标记物,出现于多种癌症中,如精原细胞瘤、卵巢癌等。现在认为,人类AP的同工酶至少来源于4种不同的基因:PLAP基因、类PLAP基因、IAP基因和TNAP基因,其中TNAP基因表达后经过不同的修饰形成肝脏、肾脏、骨等次级同工酶,PLAP基因也被认为是类PLAP基因复制与突变的产物。前3种基因位于染色体2q34-37,TNAP基因位于染色体的1q34—36。其它哺乳动物AP研究的报道多集中在鼠、猪、兔、猫、牛和犬等,主要研究和应用的是血清AP,动物血清AP和人体一样是一组同工酶,主要来源于骨骼、肝脏、胎盘和小肠等。哺乳类AP确切的生物学功能和作用机制还不十分清楚。目前认为骨骼的矿化依赖于正常的AP的活动,对此观点最直接的证据可能是低磷酸酯酶症。低磷酸酯酶症是一种先天性代谢紊乱的骨疾病,为TNAP编码的结构基因发生突变,使血液中AP活力低于正常水平,表现为骨化及骨发育不全,至今已有200多种TNAP突变基因型被报道,虽然还无法治愈,但最近间叶干细胞移植的成功为该病的治疗提供了新的途径(Orimo,2010)。另外,在运输营养物质的组织中如小肠上皮刷状缘表面、胎盘合胞体滋养层表面、胆小管表面细胞膜上AP的含量很高,提示AP与磷酸的转移和代谢有关。总之,不同组织和器官的AP有不同的生理功能,但有一些仍然是未知的。3碱性磷酸酶的应用AP在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上,测定血清中AP的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查,患这些疾病时,肝细胞过度制造AP,经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清AP明显升高(Fer-nandez等,2007)。而血中肠型AP明显升高可见于各种肠道疾病,也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP,此种AP同工酶出现的机理尚未清楚。AP同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识,如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLAP。骨型AP作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视;血清骨型AP活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参